李少南

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

1 引言

微生物群落對于土壤肥力的保持起著十分重要的作用.這種肥力多是通過對植物材料的分解和從空氣中固氮并與植物共生等微生物活動來實現(xiàn)的.近來人們還認(rèn)識到微生物群落在土壤適應(yīng)性進化中的貢獻(xiàn).這種貢獻(xiàn)體現(xiàn)在對土壤微生物基因庫的維持，使土壤中能夠很快產(chǎn)生新的基因組，以應(yīng)對土壤使用方式的多樣性變化（Soulas and Lors,1999）.考慮到農(nóng)藥中的許多品種直接在土壤中使用，即使用于葉面處理的藥劑，使用后亦有70%~80%落在了土壤表面，人們關(guān)注它們對土壤微生物群落的影響就不難理解了.農(nóng)藥管理部門規(guī)定，用于農(nóng)藝、園藝、林業(yè)等的植物保護劑（即農(nóng)藥），生產(chǎn)商必須提供有關(guān)產(chǎn)品對土壤微生物群落影響的資料.這些資料必須足以闡明其產(chǎn)品在推薦劑量和方法下使用后對土壤微生物群落是否有不利影響；如果有，影響所持續(xù)的時間究竟有多長.

2 資料要求

化學(xué)品對土壤微生物群落的影響是多方面的，人們可以從不同角度進行研究.Locke和Zablotowicz（2004）將研究終點歸納為3類，即生物量（Biomass）、土壤酶活性（Soil enzyme activity）和氮素可礦化性（Mineralizable N）.美國California州環(huán)保署在最近起草的一份文獻(xiàn)中將研究終點歸納為4類，即生物量（Biomass）、種群（Population）、活性（Activity）和多樣性（Diversity）.每一類當(dāng)中又包含若干種不同的終點（OEHHA,2008）.對于這些終點的研究，有助于人們從不同側(cè)面了解農(nóng)藥對土壤微生物負(fù)面影響.從實踐角度，只有那些與風(fēng)險管理目標(biāo)相對吻合的研究終點，才可能被納入風(fēng)險評估的“資料要求”.

評估農(nóng)藥對土壤微生物的風(fēng)險，其“資料要求”主要涉及微生物群落的“碳轉(zhuǎn)化（Carbon turnover）”和“氮轉(zhuǎn)化（Nitrogen turnover）”功能在暴露期間所受的影響（FAO,1981；1989；EPPO,2003）.所謂“碳轉(zhuǎn)化”是指土壤微生物轉(zhuǎn)化有機碳成為二氧化碳的能力.而所謂“氮轉(zhuǎn)化”是指土壤微生物通過氨化和硝化反應(yīng)轉(zhuǎn)化含氮有機物成為硝酸根的過程.“氮轉(zhuǎn)化”與“碳轉(zhuǎn)化”是關(guān)系密切的生命過程.對“氮轉(zhuǎn)化”的檢測，往往可以折射出待測物對土壤“碳轉(zhuǎn)化”能力的影響.因為氨化和硝化過程是緊隨有機物“碳—氮”鍵的斷裂而發(fā)生的.如果硝酸根的形成速率在處理和對照土之間沒有差異，則可以有把握地推斷，土壤的“碳轉(zhuǎn)化”功能沒有受到顯著影響（OECD,2000a）.

研究農(nóng)藥對土壤微生物的影響，既可以在室內(nèi)，也可以在溫室或田間進行.所謂室內(nèi)試驗，就是農(nóng)藥的添加、土壤微生物的暴露、功能檢測等環(huán)節(jié)均在室內(nèi)條件下進行.溫室或田間試驗與室內(nèi)試驗的主要區(qū)別在于前兩者是將供試藥劑施用于田間，并在施藥后的不同時間選點取樣，然后在室內(nèi)完成功能檢測.農(nóng)藥風(fēng)險評估試驗一般從室內(nèi)開始.對許多農(nóng)藥來說，室內(nèi)試驗已經(jīng)能夠滿足風(fēng)險評估的需要.當(dāng)室內(nèi)試驗證明農(nóng)藥對土壤微生物群落存在風(fēng)險，或者風(fēng)險性難以通過室內(nèi)試驗加以判斷時，需要進一步開展溫室或田間試驗.

目前國內(nèi)外尚未制訂出與風(fēng)險評估模型相配套的土壤微生物田間試驗方法.農(nóng)藥管理機構(gòu)正在討論和醞釀制訂相關(guān)的試驗準(zhǔn)則（EPPO,2003）.本文以室內(nèi)試驗為例，對土壤微生物試驗的方法學(xué)要素加以剖析.

3 試驗要素

3.1 土樣

土壤中包含多種微生物.它們在土壤中的關(guān)系復(fù)雜，具有一定的抗外界干擾能力.外來化學(xué)品對土壤微生物群落某一部分造成損害，因此而喪失的功能，有可能被群落的另一部分所補償.現(xiàn)今人們普遍認(rèn)同，研究農(nóng)藥對土壤微生物的影響，其著眼點應(yīng)該放在群落的整體功能上.以土壤中分離的菌株作為研究對象時，雖然也能提供不少有關(guān)農(nóng)藥和土壤微生物相互作用的信息，但此類信息并不能反映群落整體在土壤中的實際情況.因此人們在研究農(nóng)藥對土壤微生物影響時，大多以具有微生物活性的土壤，而不是純培養(yǎng)的微生物菌株作為研究單位.

3.1.1 物理性能

土壤的一些物化特征，如粘粒含量、陽離子代換量、pH值、有機質(zhì)含量等，會不同程度地影響農(nóng)藥在土壤中的吸附與揮發(fā)，進而影響農(nóng)藥對土壤微生物的生物有效性（Bioavailability）.因此在大多數(shù)情況下，土壤微生物試驗需要以一種以上的不同性質(zhì)的土樣（如砂土和壤土）作為試驗材料.

美國EPA（1996）要求供試土樣達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：pH 4~8、有機質(zhì)含量1%~8%、陽離子代換量大于70meq·kg-1、砂粒（作者注——粒徑介于2~0.02mm之間）含量不超過70%.

OECD（2000a;2000b）給出了其對供試土樣的要求：砂粒含量介于50%~75%之間；pH值介于5.5~7.5之間；有機碳含量介于0.5%~1.5%之間；土樣的微生物碳含量不低于該土樣有機碳總含量的1%.

上述指標(biāo)范圍被OECD稱作是對土樣的“最差狀況（Worst cast situation）”.所謂“最差狀況”，意味著此類土樣為農(nóng)藥提供了相對高的生物有效性.如果以該土樣作為測試單元，測得的農(nóng)藥影響不明顯，就無需用其他土樣再進行測試（OECD, 2000a;2000b）.

3.1.2 土樣采集

OECD認(rèn)為取土深度應(yīng)該控制在土表以下0~ 20cm.如果在溫室或非耕地取土，深度可延伸到土表以下25cm.土樣最好取自谷類作物（玉米除外）或密植的綠肥田.選中的田塊應(yīng)該停用農(nóng)藥至少1年，并且應(yīng)該至少6個月未使用化肥或至少3個月未使用有機肥（OECD,2000a;2000b）.

3.1.3 篩分和貯存

手工剔除土樣中的蚯蚓、節(jié)肢動物、石子、植物根系等大塊雜質(zhì)（如果有的話）.然后將土樣晾置到可以過篩為止（對一般農(nóng)田土樣而言，此時的含水量大約為12%）.使土樣過2mm篩.調(diào)節(jié)土樣含水量至其飽和持水量的40%~60%.按上述步驟處理過的土樣，可在溫度（4±2）℃、通風(fēng)、避光的條件下貯存.但OECD認(rèn)為即使在上述條件下，土樣的貯存期最長也不宜超過3個月，過長時間的貯存會使土壤微生物活性明顯下降，或使微生物區(qū)系的原始狀況發(fā)生改變（OECD,2000a;2000b）.

3.1.4 恢復(fù)培養(yǎng)

經(jīng)過較長時期貯存的土樣一般不能直接用于試驗，而是應(yīng)該經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕謴?fù)性培養(yǎng)，以恢復(fù)貯存過程中喪失的土壤微生物活性.恢復(fù)培養(yǎng)是否達(dá)到預(yù)期的效果，應(yīng)該經(jīng)過適當(dāng)程序加以驗證. OECD對恢復(fù)培養(yǎng)合格土樣的生物量指標(biāo)提出了以下要求，即土樣中微生物碳含量不低于該土壤有機碳總含量的1%（OECD,2000a；2000b）.

3.2 底物

底物的作用首先在于提高土樣中微生物的生物量，使之達(dá)到試驗準(zhǔn)則所要求的水平.根據(jù)實際需要，底物既可在加藥前的恢復(fù)培養(yǎng)期，也可在加藥后的培育過程中添加.至于底物的種類，OECD主張使用鮮苜蓿粉，由紫花苜蓿Medicago sativa制成，其C/N介于12/1~16/1之間，一般按照每kg干土5g的比率添加（OECD,2000a）.美國EPA推薦的底物是經(jīng)過0.6mm篩分選的苜蓿干粉.該底物添加率多為6%（w/w）（EPA,1996）.

除了用于提高微生物的生物量，底物還具有啟動和刺激微生物功能發(fā)揮的作用.如OECD的“碳轉(zhuǎn)化”試驗要求在每次測試中向每kg干重的土樣中添加高劑量（2000~4000mg）葡萄糖以刺激微生物的碳轉(zhuǎn)化活性（OECD,2000b）.

3.3 培育系統(tǒng)

3.3.1 培育容器

按照美國EPA（1996）的測試準(zhǔn)則，培育容器應(yīng)該能夠容納50g土樣，并且具有足夠的換氣空間（100mL左右的玻璃廣口瓶能滿足這方面要求）.如果土樣的用量增加，容器的體積應(yīng)該相應(yīng)擴大.為了減少容器內(nèi)的水分散失，瓶口可用聚乙烯薄膜等覆蓋，但是這種覆蓋不應(yīng)該過分阻隔空氣流通；也可以將瓶口完全敞開，每隔一定時間（如7d）補充一次水份，以恢復(fù)土壤含水量到起始水平.

3.3.2 加藥方式

水溶性原藥和可以在水中分散的農(nóng)藥制劑，如乳油、可濕性粉劑、水乳劑、懸浮劑等，可以直接用水稀釋，然后使稀釋液與土樣混勻.

如果藥劑難溶于水，又難以直接與土樣混合，可先用少量有揮發(fā)性機溶劑（如丙酮、氯仿）將其溶解，再將藥液涂布在少量細(xì)土或石英細(xì)砂（粒徑0.1~0.5mm）表面，待溶劑揮發(fā)后，將吸附有藥劑的細(xì)土或石英細(xì)砂進一步分散到土樣中去.注意不可將溶解于有機溶劑的藥液直接與土樣混合.因為這樣做有可能會破壞土樣中微生物區(qū)系的完整性.

有些內(nèi)含石礫核心的顆粒劑，由于體積較大而難以與土樣均勻混合.遇到這種情形，可先用水或有機溶劑將外包物洗脫，再做下一步處理.

3.3.3 劑量設(shè)置

如果農(nóng)藥在環(huán)境中的起始濃度可以推測，應(yīng)優(yōu)先以起始環(huán)境濃度為依據(jù)進行測試；反之，當(dāng)環(huán)境濃度無法推測時，人們可以主觀地選擇一系列濃度進行測試，直至獲得 EC50數(shù)值（EPA,1996; OECD,2000a;2000b）.

起始環(huán)境濃度的推測，一般以施藥劑量為依據(jù).如此推測時，OECD認(rèn)為可以設(shè)定施用的藥劑100%進入土壤，并且均勻分布于地表0~5cm的土層，土壤密度為1.5g·cm-3（OECD,2000a;2000b）.

OECD認(rèn)為農(nóng)藥的測試劑量至少應(yīng)該包括“推測環(huán)境濃度（Predicted Environmental Concentration, PEC）”以及PEC的5倍濃度.對于那些多次使用的藥劑，可以考慮以PEC乘以使用次數(shù)的模式確定最高測試濃度.然而最高測試劑量不必超過單次用藥PEC的10倍（OECD,2000a;2000b）；

美國EPA的測試準(zhǔn)則規(guī)定，農(nóng)藥試驗可選擇PEC的0.1倍、1.0倍和10倍作為測試劑量.若采用主觀設(shè)定的系列濃度法進行測定，最高測試濃度一般不超過1000mg·kg-1（干土）.EPA認(rèn)為在1000mg·kg-1（干土）的測試濃度下，如果供試藥劑對土壤微生物活性的抑制率低于50%，試驗即可終止（EPA,1996）；

蔡道基等（1986）根據(jù)我國當(dāng)時的農(nóng)藥平均使用量，提出采用1、10、100mg·kg-13個濃度進行測試.考慮到不同農(nóng)藥田間用量的差別，國家環(huán)保局在稍后制定的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》中對此項內(nèi)容做了修改，主張以農(nóng)藥常用量（即推薦的最大用量）、常用量的10倍量、常用量的100倍量時表層土壤中農(nóng)藥的推測含量作為測試劑量（蔡道基，1989）.

微生物試驗的每一濃度組（包括對照）應(yīng)該設(shè)置重復(fù).美國EPA要求每一濃度組設(shè)5個重復(fù)（EPA,1996）.OECD認(rèn)為每一濃度組至少需設(shè)3個重復(fù)（OECD,2000a；2000b）.

3.3.4 培育條件

溫度方面，OECD準(zhǔn)則規(guī)定藥劑處理過的土樣應(yīng)該在20℃下培育，培育期間的溫度變幅不應(yīng)超過±2℃（OECD,2000a；2000b）.美國EPA推薦的培育溫度為22℃（EPA,1996）.也可以將試驗當(dāng)?shù)赝寥牢⑸镒顬檫m應(yīng)的生長溫度作為活性土壤的培育溫度（EPA,1996；OECD,2000a；2000b）.我國的化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則將25℃作為活性土壤的培育溫度（蔡道基，1989）.

濕度方面，以旱地微生物區(qū)系作為研究對象時，土壤的培育濕度一般控制在飽和持水量的40%~60%（OECD,2000a;2000b）或者10kPa（EPA, 1996）.如果試驗對象涉及藻類，培育濕度可以提高到土壤的飽和持水量.“氮轉(zhuǎn)化”試驗中可采用的土樣培育方法有兩種：即“散裝培育”或“分裝培育”.一個處理的“散裝培育”土樣包含多個分樣，在整個培育過程中，各分樣可以被分批采集；而一個處理的“分裝培育”土樣中只包含一個分樣，該分樣只能在培育終結(jié)時采集.在加藥操作上，“散裝培育”具有省工的優(yōu)點，也有助于減少試驗誤差.但是如果供試藥劑揮發(fā)性較強，“分裝”則被認(rèn)為是唯一可供選擇的培育方式（OECD,2000a; 2000b）.

培育過程中一般要避免光照.這樣做一方面為了避免農(nóng)藥見光分解，另一方面可以抑制土壤中藻類的生長.

3.3.5 取樣規(guī)劃

對于農(nóng)藥類化學(xué)品，OECD規(guī)定土壤微生物試驗的持續(xù)時段至少應(yīng)達(dá)到28d.土樣（包括分樣）的采集應(yīng)該在藥劑處理后的第0d、第7d、第14d和第28d進行.在對第28d的樣品進行檢測后，如果發(fā)現(xiàn)處理組和對照組土壤微生物活性的差異超過25%，OECD認(rèn)為應(yīng)適當(dāng)延長試驗周期，直至處理組和對照組土壤微生物活性的差異低于25%，但延長的最大時限不應(yīng)超過 100d（OECD,2000a; 2000b）.

對于非農(nóng)藥類化學(xué)品，OECD將試驗持續(xù)的時段設(shè)定為28d，在第7d和第28d取土樣或采集分樣，利用第28d的數(shù)據(jù)計算ECx值（OECD,2000a; 2000b）.

將美國EPA試驗持續(xù)的時段設(shè)定為28d，土樣或分樣的采集在第5d和第28d進行，利用第28d的數(shù)據(jù)計算ECx值（EPA,1996）.

我國的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》規(guī)定15d作為農(nóng)藥對土壤微生物影響的一個試驗周期，取樣在藥劑處理后的第0d、第5d、第10d和第15d進行（蔡道基，1989）.

3.3.6 系統(tǒng)質(zhì)量要求

土壤微生物試驗結(jié)果多是以處理組相對于對照組功能的下降率（±25%）作為評判依據(jù)，若試驗組內(nèi)各重復(fù)之間的測定值差異過大，將會影響對試驗結(jié)果的評判.OECD規(guī)定對照組內(nèi)各重復(fù)間的測定值差異不應(yīng)超過±15%（OECD,2000a; 2000b）.

3.4 檢測方法

3.4.1 “氮轉(zhuǎn)化”

微生物的“氮轉(zhuǎn)化”活性，通常以有機氮轉(zhuǎn)化為NH4+的速率和/或NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-的速率來表示.而農(nóng)藥對“氮轉(zhuǎn)化”活性的影響則通過處理組相對于對照組NH4+和/或NO3-生成的下降率來表示.為此需要將土樣中的NH4+和NO3-加以提取. OECD和美國EPA分別給出了NH4+和NO3-的提取方法：

按照OECD試驗準(zhǔn)則，將5mL 0.1mol·L-1的KCl加入相當(dāng)于1g干重的土樣，初步搖動后，將混合液置于150rpm的搖床上振蕩60min，離心，取上清液，測定其中NH4+和NO3-濃度.來不及測定的上清液可在室溫（20±5）℃下保存，OECD認(rèn)為貯存期不宜超過6個月（OECD,2000a）.

按照美國EPA的試驗準(zhǔn)則，將80mL 0.1mol· L-1的KCI加入內(nèi)含相當(dāng)于50g干重土樣的試驗容器中.初步搖動后，將容器至于搖床上繼續(xù)振蕩1h，提取液經(jīng)低氮濾紙（如Whatman 42號定量濾紙） 過濾后，用于 NO3-或 NH4+檢測（EPA, 1996）.

NO3-和NH4+檢測方法很多.具體可參見嚴(yán)昶生（1988）.

3.4.2 “碳轉(zhuǎn)化”

微生物的“碳轉(zhuǎn)化”活性通常以土壤在單位時間內(nèi)對氧氣的吸收率或?qū)Χ趸坚尫怕蕘肀硎?而農(nóng)藥土壤微生物“碳轉(zhuǎn)化”活性的影響，可通過處理組相對于對照組氧氣的吸收或?qū)Χ趸坚尫诺南陆德蕘砗饬?

對于二氧化碳釋放，美國EPA推薦在氣體流通狀態(tài)下測量.其原理是將內(nèi)含土樣并經(jīng)過一段時間密閉的培育容器，經(jīng)由進、出氣體的兩個通道，分別與氣泵和紅外氣體檢測器（Infrared gas analysis,IRGA）相連.通道上分別安裝有可控開關(guān).氣泵提供的不含二氧化碳的濕潤氣流通過進氣通道進入培育容器，氣流攜帶土壤呼吸作用釋放出的二氧化碳，經(jīng)出氣通道和干燥器而到達(dá)IRGA.在氣體的流速確定的前提下，土樣在容器內(nèi)的密閉培養(yǎng)時間需要通過預(yù)試驗加以調(diào)節(jié)，使出氣通道內(nèi)二氧化碳的分壓與IRGA的檢測靈敏度相匹敵，同時又不會因為密閉培養(yǎng)而使容器內(nèi)氧氣過多下降，以致影響土壤微生物的正常生長. EPA認(rèn)為密閉培養(yǎng)的時間以 1~77h為宜（EPA, 1996）.

為了刺激土樣的瞬時呼吸率，OECD推薦在每一測試之前按2000~4000mg·kg-1（干土）的量向土樣中添加葡萄糖，經(jīng)過12h左右密閉培養(yǎng)之后加以測定（OECD,2000b）.

除了使用IRGA，土壤呼出的二氧化碳還可以用氫氧化鈉吸收，再通過滴定或氣相色譜法檢測.我國國家環(huán)保局推薦了一種簡易的土壤二氧化碳吸收裝置，目前被我國的農(nóng)藥登記試驗單位普遍采用（蔡道基，1989）.該裝置以密閉的廣口瓶作為培養(yǎng)容器.植入土樣的同時，每只廣口瓶中放入一只盛有5mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的小燒杯，再將整個廣口瓶移至（25±1）℃的恒溫箱中培養(yǎng).至于取樣計劃，起初是在試驗開始后的第0d、第5d、第10d和第15d進行（蔡道基，1989），后來變更為試驗后的第1d、第2d、第4d、第7d、第11d和第15d.此處所謂“取樣”，是指從密閉廣口瓶中取出培養(yǎng)開始時（第0d）放置的小燒杯，同時將一個新的小燒杯放在原來位置以繼續(xù)CO2的吸收.“取樣”的同時也更換了廣口瓶中的空氣，不至于使瓶中氧氣分壓下降到明顯影響土壤呼吸作用的程度.

堿液中吸收的CO2可以參考中科院南京土壤研究所微生物室（1985）的方法進行測量.

目前我國室內(nèi)測量農(nóng)藥對土壤“碳轉(zhuǎn)化”的影響，其測量終點與OECD和美國EPA的稍有不同：前者測的是土壤微生物在整個溫育時段（如0~1d、0~2d、0~4d、0~7d、0~11d、0~15d）的“碳轉(zhuǎn)化”效率，而后者測的是土壤微生物在溫育的某一時間點（如第0d、第7d、第14d、第28d）的“碳轉(zhuǎn)化”效率.除了作用強度，農(nóng)藥在土壤中發(fā)揮作用的時間也是衡量其對微生物影響的一個重要因素.我國以整個暴露時段內(nèi)土壤二氧化碳的釋放量作為測量終點，從這一點上看，具有其合理的一面.但是在溫室和田間試驗中，人們很難進行類似的測定，而比較容易測量土壤微生物在試驗階段的某一時間點的碳轉(zhuǎn)化效率，因此OECD和美國EPA的測量方法可用于不同層次間的試驗，也易于試驗結(jié)果的相互比較.

3.5 評價

Johnen和Drew早在1977就年提出了一套以功能的恢復(fù)時間作為關(guān)注水平（Level of concerns, LOCs）的風(fēng)險評估體系.此體系中，對于室內(nèi)試驗和野外試驗而言，恢復(fù)時間<15d和<30d，為無風(fēng)險；恢復(fù)時間15~30d和30~60d，為略有風(fēng)險但可以忍受；>30d和>60d，為有風(fēng)險.比如某一農(nóng)藥對土壤微生物的影響需要20d恢復(fù)，對于野外試驗而言，該農(nóng)藥屬于“無風(fēng)險”等級，對于室內(nèi)試驗，該農(nóng)藥則屬于“略有風(fēng)險但可以忍受”.Johnen和Drew評估體系，其室內(nèi)試驗的評價標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)于室外.之所以如此設(shè)置，目的在于防止室內(nèi)試驗出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果：如果室內(nèi)試驗證明農(nóng)藥對土壤微生物“無風(fēng)險”，風(fēng)險也不可能在野外發(fā)生；反之，如果室內(nèi)試驗顯示農(nóng)藥對土壤微生物“有風(fēng)險”，可以進一步開展溫室或田間試驗，以確認(rèn)類似的風(fēng)險是否會在野外發(fā)生.Johnen和Drew的這一評估體系得到了聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）的認(rèn)可（FAO, 1981）.凡以環(huán)境濃度為依據(jù)的試驗，其結(jié)果均可應(yīng)用該體系進行評估.

在微生物風(fēng)險的評估中，聯(lián)邦農(nóng)林生物研究中心（Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,BBA）將對照組和處理組微生物活性的差異作為關(guān)注目標(biāo).它為室內(nèi)和野外試驗設(shè)定的LOCs分別是15%和25%.按照這套評估體系，在歷時不超過90d的室內(nèi)暴露之后，對照組和處理組之間土壤微生物活性的差異如果低于15%，供試藥劑對微生物的影響被認(rèn)為“可以接受”；反之，如果差異超過15%，則需要進一步開展溫室或田間試驗.BBA規(guī)定的溫室或田間試驗歷時不超過120d.通過試驗，對照組和處理組之間土壤微生物活性的差異如果低于25%，供試藥劑的影響被認(rèn)為“可以接受”，如果差異超過25%，供試藥劑則被認(rèn)為對土壤微生物有不良影響.為了消除或減輕這種不良影響，農(nóng)藥管理部門或許會對該藥劑的使用范圍施加某種限制（Ehle,1993）.

歐洲和地中海植保組織 （European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO）將農(nóng)藥的土壤微生物風(fēng)險等級進行了如下劃分并給出了相應(yīng)的處理意見（EPPO,2003）：1）通過28d的室內(nèi)暴露，如果處理組相對于對照組土壤微生物活性的差異未超過25%，該藥劑被認(rèn)為“低風(fēng)險”；2）通過28d的室內(nèi)暴露，如果處理組相對于對照組土壤微生物活性的差異達(dá)到或超過25%，應(yīng)該延長暴露時間進一步測試，但最終的暴露時間不應(yīng)超過100d；3）延長暴露時間后，如果處理組相對于對照組土壤微生物活性的差異未超過25%，該藥劑被認(rèn)為具有“中等風(fēng)險”；反之，如果處理組相對于對照組土壤微生物活性的差異達(dá)到或超過25%，該藥劑被認(rèn)為具有“高風(fēng)險”；4）對于室內(nèi)判斷為“高風(fēng)險”的藥劑，一般需開展溫室或田間試驗，以明確供試藥劑在實際應(yīng)用中的風(fēng)險程度、范圍和持續(xù)時間.

蔡道基等（1986）針對15d室內(nèi)試驗提出了毒性等級劃分的下列標(biāo)準(zhǔn)：1）在1mg·kg-1（干土）的試驗濃度下，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降率達(dá)到或超過50%，供試藥劑對土壤微生物“高毒”；2）在10mg·kg-1（干土）的試驗濃度下，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降率未達(dá)到50%，供試藥劑對土壤微生物“低毒”；3）在10mg·kg-1（干土）的試驗濃度下，處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降率達(dá)到或超過50%，而在1mg·kg-1（干土）的試驗濃度下，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降率未達(dá)到50%，供試藥劑對土壤微生物具有“中等毒性”.

上述劃分主要基于以下假設(shè)：1）大多數(shù)農(nóng)藥的最高田間用量不超過750g·hm-1；2）均勻施用的農(nóng)藥大多分布在距地表0~5cm、容重為1.5g·cm-3的土層中；3）基于上述兩個假設(shè)大多數(shù)農(nóng)藥在土壤中的最高起始濃度不超過1mg·kg-1干土；4）在最高起始濃度下，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度達(dá)到或超過50%，說明該農(nóng)藥對土壤微生物“高毒”；5）在“條施”或“點施”等特殊施藥條件下，農(nóng)藥在農(nóng)田中的分布面積僅有均勻施藥時的1/10，或者說農(nóng)藥在局部農(nóng)田中的最高起始濃度可能達(dá)到均勻施藥時的10倍，即10mg·kg-1（干土）.在此前提下，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說明該農(nóng)藥對對土壤微生物“低毒”.

衡量農(nóng)藥對土壤微生物的影響，除抑制程度之外，抑制作用所持續(xù)的時間具有同樣重要的意義.蔡道基等（1986）綜合抑制程度、抑制所持續(xù)的時間，以及造成該抑制所需的暴露濃度三方面因素，提出使用“危害系數(shù)”評估農(nóng)藥對土壤微生物影響的設(shè)想.“危害系數(shù)”，可由下列公式來計算：

農(nóng)藥的“危害系數(shù)”可以被劃分成下列3個等級：1）“危害系數(shù)”≥200，具有“嚴(yán)重危害”；2）200>“危害系數(shù)”≥20.0，具有“中等危害”；3）“危害系數(shù)”<20.0，“無實際危害”.

上述劃分的主要依據(jù)是：1）在1mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過120d（即4個月，相當(dāng)于1個生長季）的暴露期，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度仍然能夠達(dá)到或超過50%，說明該農(nóng)藥對對土壤微生物具有“嚴(yán)重危害”；2）在10mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過120d的暴露期，如果處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說明該農(nóng)藥對對土壤微生物“無實際危害”；3）在10mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過120d的暴露期，處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度達(dá)到或超過50%，但是在1mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過同樣的暴露期，處理組相對于對照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說明該農(nóng)藥對對土壤微生物具有“中等危害”.

“危害系數(shù)”可用于田間試驗的結(jié)果評估.需要指出的是，為計算“危害系數(shù)”所開展的田間試驗，其持續(xù)時間應(yīng)該是120d，而不是室內(nèi)試驗所采用的15d.

研究和確定農(nóng)藥對土壤微生物的影響，是農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估和風(fēng)險管理的客觀需要.而關(guān)注這方面問題，是農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)向生態(tài)毒理學(xué)發(fā)展的一個重要標(biāo)志.針對土壤微生物的化學(xué)品評估試驗，無論在室內(nèi)、溫室，還是在田間進行，均屬于系統(tǒng)層次的研究.室內(nèi)就相當(dāng)于一個土壤微宇宙試驗.此類試驗之所以選擇功能性指標(biāo)作為測試終點，是因為這類指標(biāo)是土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)水平以及系統(tǒng)抗脅迫能力的集中體現(xiàn).對土壤微生物而言，以室內(nèi)試驗結(jié)果推測其在野外可能受到的影響，比起其他類型的非靶標(biāo)生物做類似推測時的結(jié)果可靠性要強得多.室內(nèi)試驗關(guān)鍵的一點，是要保持土樣中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的完整性，在試驗過程中不會受到藥劑以外的因素的破壞.

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