厲金雷 余 震 胡 禮 王蓉蓉 張 行

中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白表達(dá)與胃癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系*

厲金雷 余 震△胡 禮 王蓉蓉 張 行

目的：探討中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白（NGAL）在胃癌組織中的表達(dá)及與胃癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)NGAL在102例胃癌、32例正常胃組織中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：NGAL在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.9%，明顯高于在正常胃組織中的21.9%（χ2=11.938，P<0.01），不同胃癌組織學(xué)分型患者NGAL陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.180，P<0.05），胃癌患者NGAL表達(dá)與漿膜侵犯、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及 T 分期呈正相關(guān)（rs分別為 0.307、0.211、0.220、0．201，P<0．05 或 P<0．01）。NGAL 表達(dá)陽(yáng)性組和陰性組5年累積生存率分別為24.3%和43.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。結(jié)論：NGAL在胃癌中表達(dá)上調(diào)，與胃癌進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示預(yù)后不良，可作為評(píng)價(jià)胃癌預(yù)后新的生物學(xué)指標(biāo)。

中性白細(xì)胞 載脂蛋白類 胃腫瘤 癌 淋巴轉(zhuǎn)移 預(yù)后 免疫組織化學(xué)

中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）是 lipocalin 家族的新成員，由Kjeldsen等[1]于1993年首先發(fā)現(xiàn),分子質(zhì)量25 ku，由一條多肽鏈構(gòu)成,含有178個(gè)氨基酸殘基。此后研究證明，NGAL與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、組織重構(gòu)以及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，NGAL 在胰腺癌[2]、食管癌[3]、卵巢癌[4]等惡性腫瘤中異常表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，成為近年來(lái)腫瘤轉(zhuǎn)移研究的新熱點(diǎn)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)NGAL在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討NGAL作為有效預(yù)后指標(biāo)的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2004年11月—2005年3月我院102例胃癌患者手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本，選取同期在我院32例診斷為胃十二指腸消化性潰瘍患者行胃大部切除術(shù)標(biāo)本，離病灶≥5 cm處取胃黏膜組織做對(duì)照研究。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診并依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第5版進(jìn)行胃癌TNM分期。所有患者均有完整病歷資料，無(wú)嚴(yán)重心肺疾病，術(shù)前均未行放療及化療，非復(fù)發(fā)再手術(shù)病例，非急診手術(shù)病例。所有患者均行手術(shù)治療。隨訪主要通過(guò)電話、查閱門診復(fù)診病歷、上門拜訪等方式進(jìn)行。隨訪從確診之日開(kāi)始，每3個(gè)月1次，直至2010年3月或患者死亡或失訪。疾病特異生存時(shí)間為確診胃癌之日起至患者死于胃癌或隨訪截止時(shí)間。

1.2主要試劑 羊抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R＆D公司（目錄號(hào)：AF1757；簽號(hào)：JBH04）；免疫組化試劑盒（PV－9003）、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化SP法，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原枸櫞酸鹽微波修復(fù)，過(guò)氧化氫常溫下滅活內(nèi)源性酶，牛血清封閉非特異性抗原，一抗（工作濃度5 mg/L）4℃孵育過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育30 min，DAB光鏡下顯色、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以已知胰腺癌陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 NGAL蛋白定位于細(xì)胞漿,以出現(xiàn)棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異性著色者為陽(yáng)性。由2位病理學(xué)專家獨(dú)立閱片，確定免疫組化結(jié)果。采用IP（Intensity＋Percentages）評(píng)分方法[5]，綜合考慮染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。（1）染色強(qiáng)度記分：細(xì)胞漿無(wú)染色或與背景非特異性著色一致者記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。（2）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)記分：細(xì)胞漿無(wú)染色評(píng)定為0，染色細(xì)胞個(gè)數(shù)<1%評(píng)定為1，1%～10%評(píng)定為2，>1/10且<1/3評(píng)定為3，1/3～2/3評(píng)定為4，＞2/3評(píng)定為5。以上兩項(xiàng)相加即得總分（范圍0～8分），＜2分為陰性，2～8分為陽(yáng)性；2～4分為低表達(dá)，5～6分為中等表達(dá)，7～8分為高表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同臨床病理情況患者NGAL表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)；NGAL表達(dá)與漿膜侵犯、胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期（原發(fā)灶浸潤(rùn)胃壁深度）的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析；應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算疾病累積生存率,生存率差異比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NGAL在胃癌和胃正常組織中的表達(dá) NGAL蛋白在胃癌的表達(dá)情況，見(jiàn)圖1、2。NGAL在32例正常胃組織中7例（21.9%）陽(yáng)性表達(dá)，均為低表達(dá)，在102例胃癌組織中58例（56.9%）陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.938，P<0.01）。

圖1 胃癌脈管癌栓NGAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化SP法×200）

圖2 胃癌原發(fā)灶NGAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化SP法×200）

2.2不同臨床病理情況胃癌患者NGAL表達(dá)情況比較 不同年齡、性別、肉眼腫瘤分型胃癌患者NGAL陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余不同臨床病理情況胃癌患者NGAL陽(yáng)性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表1。NGAL表達(dá)與漿膜侵犯、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及T分期呈正相關(guān)（rs分別為 0.307、0.211、0.220、0.201，P<0.05或 P<0.01）。

表1 NGAL蛋白表達(dá)與胃癌臨床和病理類型關(guān)系 例（%）

2.3NGAL表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 胃癌患者中NGAL表達(dá)陽(yáng)性組和陰性組中位生存時(shí)間分別為33個(gè)月和43個(gè)月；5年累積生存率分別為24．3%和43．7%；NGAL表達(dá)陽(yáng)性組的預(yù)后明顯差于陰性組，2組生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．018），見(jiàn)圖 3。

圖3 不同NGAL表達(dá)情況胃癌患者的生存曲線

3 討論

已有研究證實(shí)，NGAL可與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）－9形成復(fù)合物，增加 MMP－9活性，并可拮抗基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）－1對(duì)MMP－9的抑制作用，促進(jìn)MMP－9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[6]。本研究顯示NGAL表達(dá)與漿膜侵犯呈正相關(guān)。尤其是脈管癌栓形成的胃癌中，NGAL在脈管癌栓中強(qiáng)表達(dá)，提示NGAL可能是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制中的重要分子。據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)胃癌細(xì)胞分泌的NGAL蛋白先進(jìn)入脈管，通過(guò)脈管運(yùn)輸?shù)狡渌课?，參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。此外，NGAL表達(dá)與胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)灶浸潤(rùn)胃壁的深度呈正相關(guān)，表明NGAL陽(yáng)性表達(dá)的胃癌生物學(xué)惡性程度較高，容易發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。NGAL在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未完全闡明，但已有研究證實(shí)NGAL在腫瘤組織的高表達(dá)促進(jìn)了自身與MMP－9形成復(fù)合物，此復(fù)合物抑制MMP－9自我降解，上調(diào)細(xì)胞外腫瘤相關(guān)性MMP－9的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的釋放，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)[7]，此復(fù)合物促進(jìn)新生血管的形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。NGAL還可下調(diào)E-鈣黏蛋白表達(dá)，參與表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelio-mesenchymal transition,EMT）[2]，在腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)NGAL可與鐵高親和力結(jié)合，獨(dú)立介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，上調(diào)鐵易感基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

本研究顯示,NGAL陽(yáng)性組胃癌患者5年累積生存率明顯低于陰性組患者，提示NGAL是影響胃癌預(yù)后的因素。Fernandez等[8]報(bào)道NGAL與MMP－9可以形成復(fù)合物，從乳腺癌患者的尿液中排泄，而在正常對(duì)照組，未檢測(cè)到這種復(fù)合物。Kubben等[10]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在類似的情況。尿NGAL檢測(cè)可作為臨床上評(píng)價(jià)某些惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌治療效果和預(yù)后的新指標(biāo)。

綜上，NGAL的表達(dá)與胃癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)提示胃癌生物學(xué)惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后不良，可作為評(píng)價(jià)預(yù)后的新生物學(xué)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床合理選擇治療方案。

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The Correlation of NGAL and Clinicopathologic Progress,Metastasis and Prognosis in Gastric Carcinoma

LI Jinlei,YU Zhen,HU Li,WANG Rongrong,ZHANG Xing
The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Zhejiang 325000,China

Objective:To investigate the expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)，and the correlation of NGAL with clinicopathologic progression,metastasis and prognosis in gastric carcinoma.Methods：The expression of NGAL was observed in 102 gastric carcinoma tissues and 32 normal gastric tissues by immunohistochemistry.The correlation of NGAL expression with clinicopathologic parameters and metastasis was analyzed.Results：The positive rate of NGAL expression was 56.9%in gastric carcinoma， which was significantly higher than that in normal gastric tissue （21.9%， χ2＝11．938， P<0.01).The expression of NGAL was significantly different in patients with different histological types( χ2=10.180,P<0.05).The expression of NGAL was observed to correlate positively with serosal invasion,TNM stage,lymph node status and T stage (rs=0.307,0.211,0.220 and 0.201,P<0.01 or P<0.05).The five-year cumulative survival rates were 24.3%and 43.7%in the positive and negative NGAL expression groups.Kaplan-Meier curves showed a significant difference(P=0.018).Conclusion:NGAL expression was up-regulated in gastric carcinoma,which was significantly correlated with tumor progression and lymphatic metastasis.The expression of NGAL might be a novel molecular marker to predicate the prognosis of gastric carcinoma.

neutrophils apolipoproteins stomach neoplasms carcinoma lymphatic metastasis prognosis immunohistochemistry

*浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：Y207799）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科（厲金雷，余震，胡禮），病理科（王蓉蓉），外科實(shí)驗(yàn)室（張行）

△通訊作者 E-mail：yuzhen0577@yahoo.com.cn

（2010-04-22收稿 2010-06-15修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）