張易祥,金秀梅,李贊東*,劉 莉,采克俊,丁志麗 (.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院湖州師范學(xué)院,細(xì)胞工程研究所,浙江 湖州 33000；.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,北京 00094)

多氯聯(lián)苯(PCBs) 是聯(lián)苯被氯原子取代后的產(chǎn)物,由于其脂溶性強(qiáng),半衰期長(zhǎng),在環(huán)境中不易降解,易通過(guò)食物鏈富集在人和動(dòng)物體內(nèi),已造成全球性的污染[1-2].實(shí)驗(yàn)表明,早期胚胎暴露于PCBs中會(huì)導(dǎo)致出生后發(fā)育異常,引起睪丸、附睪、前列腺和精細(xì)管損傷,精子質(zhì)量下降[3].PCBs家族中的許多種類有雌激素作用,能干擾接觸個(gè)體或其后代的內(nèi)分泌功能,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)障礙[4-5].發(fā)育中的組織器官尤其對(duì)這類物質(zhì)敏感,在動(dòng)物發(fā)育的某些關(guān)鍵時(shí)期,一旦受到這些物質(zhì)的影響,往往對(duì)其生殖系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害,并具有遺傳性[6].2,2',5,5'-四氯聯(lián)苯(PCB 52)是 PCBs中的一種,被認(rèn)為具有雌激素活性,可干擾動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)[7].

禽類原始生殖細(xì)胞(PGCs)是精子和卵子的祖細(xì)胞,其遷移伴隨著高速增殖.這些細(xì)胞起源于胚胎外胚層,然后經(jīng)下胚層移動(dòng)到生殖新月區(qū),最后,這些細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán),在生殖原基附近穿過(guò)毛細(xì)血管壁定居到生殖原基,在生殖原基分化成精子或者卵子[8].在此過(guò)程中數(shù)量從幾十個(gè)增加到一千多個(gè).

利用禽胚研究環(huán)境污染物的影響,一直以來(lái)的操作方法是直接將污染物注入到卵黃或者受精卵氣室中.本研究利用禽PGCs遷移路線長(zhǎng)(從起源到定居需100多小時(shí)),較哺乳動(dòng)物易于操作的特點(diǎn),分離發(fā)育至14期的雞胚PGCs,用PKH26熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后做為供體細(xì)胞,顯微注射移植到用 PCB 52處理的受體雞胚生殖新月中,然后檢測(cè)血液和生殖原基中的外源 PGCs,研究PCB 52對(duì)PGCs遷移和增殖的影響.影響動(dòng)物原始生殖細(xì)胞的發(fā)育及增殖的環(huán)境因素基本相似[9],所以研究環(huán)境污染物對(duì)禽類 PGCs發(fā)育的影響,對(duì)揭示一些鳥類尤其是瀕危鳥類數(shù)量減少的原因有重要的參考意義.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

白來(lái)航種雞蛋購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)禽場(chǎng).四氯聯(lián)苯(PCB 52)和雌二醇(E2)購(gòu)自美國(guó)Accustandard 公司,溶于二甲基亞砜(DMSO),配成 100mg/mL溶液,-20℃儲(chǔ)存,使用時(shí)用最基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)稀釋.PKH26試劑盒購(gòu)自Sigma公司,操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.白消安購(gòu)于Sigma公司,使用時(shí)先用DMSO溶解,然后加入花生油充分乳化(油和 DMSO最終體積比為9:1).Nycodenz 購(gòu)自Nycomed Pharma AS公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供體雞胚血液中 PGCs的采集[10]新鮮白來(lái)航雞種蛋用 70%的酒精擦拭消毒后在38.5℃,相對(duì)濕度 70%,90°/h的轉(zhuǎn)蛋條件下培養(yǎng)56h左右,使胚胎發(fā)育至14期左右,然后用微玻璃針由胚胎血管中抽取含有 PGCs的血液,懸浮于不含血清的 Dulbecco′s MEM(DMEM)培養(yǎng)液中.800×g離心5min棄上清液,加入10μL培養(yǎng)基.

1.2.2 供體雞胚血液細(xì)胞PKH26標(biāo)記 PKH26的標(biāo)記參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,簡(jiǎn)要步驟如下:1)取細(xì)胞數(shù)1×107個(gè)/μL胚胎血細(xì)胞10μL,加試劑盒稀釋液C 200μL,然后加5×10-6mol/L的PKH26 200μL,反復(fù)顛倒離心管染色3min;2)加400μL血清,置37℃ 1min使反應(yīng)停止;3)加800μL含5%血清DMEM, 800×g離心5min,棄上清.重復(fù)洗滌3次,每次換新離心管;4)加1mL DMEM重懸.在熒光顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞的標(biāo)記率及熒光強(qiáng)度.

1.2.3 供體雞胚 PGCs 的 PKH26標(biāo)記后純化 PGCs的純化參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行,簡(jiǎn)要步驟如下:將上述標(biāo)記好的細(xì)胞 1200×g離心后棄上清,加1mL8% Nycodenz.在5mL離心管中底部加入 1mL12%Nycodenz,中部加 8%血液Nycodenz 混合液,上部加0.2mL 2% Nycodenz溶液.800×g 4℃離心 20min.收集 8%和 12% Nycodenz界面處的細(xì)胞各約0.3mL,置于離心管中.加1.4mL DMEM混勻,1200×g 4℃離心5min,重復(fù)洗滌 3次.棄上清液,加適量 DMEM,調(diào)整PGCs數(shù)為大約1000個(gè)/μL.

1.2.4 受體雞胚內(nèi)源性 PGCs的去除 用打孔器在種蛋氣室打一小孔,然后用注射器由氣室將白消安溶液注入卵黃.白消安使用濃度1.0μg/μL.每枚注射體積50μL.石蠟封口后38.5℃, 相對(duì)濕度70%, 90°/h的轉(zhuǎn)蛋條件下孵化.

1.2.5 受體雞胚的E2和PCB 52處理 將上述用白消安處理后的種蛋用牙鉆打一直徑大約5mm的窗孔,用微玻璃針將PCB 52或E2注入到靠近胚盤處,石蠟?zāi)し忾]窗口.E2劑量為每個(gè)雞胚100μmol/L,PCB 52劑量為每個(gè)雞胚10μmol/L,注射體積為每個(gè)雞胚1μL.對(duì)照分為2組,一組雞胚只注射E2或PCB 52等濃度的DMSO,一組不作任何處理(對(duì)照組受體均經(jīng)過(guò)白消安處理).

1.2.6 PKH26標(biāo)記的供體PGCs注射入處理組受體雞生殖新月區(qū)域 將上述PCB 52或E2處理過(guò)的受體種蛋在 38.5℃,相對(duì)濕度 70%,90°/h的轉(zhuǎn)蛋條件下培養(yǎng)至8～10期.然后用微注射法把上述標(biāo)記PGCs 1μL導(dǎo)入受體胚盤生殖新月區(qū)域,密封后在相同條件下繼續(xù)孵化至 13～15期和27～29期.對(duì)照組也注射相同數(shù)量的標(biāo)記PGCs.

1.2.7 注射外源 PGCs后的受體胚胎繼續(xù)孵化至13～15期時(shí)血液PGCs的采集和計(jì)數(shù) 待上述移植了標(biāo)記PGCs的受體雞胚孵化至13～15期時(shí),用鑷子小心打開(kāi)蛋殼暴露胚胎,實(shí)體顯微鏡下以微玻璃針經(jīng)背主動(dòng)脈采血 1μL,加入培養(yǎng)液中混勻,800×g離心 5min,棄上清,加入 10μL培養(yǎng)基.取 5μL涂片,熒光顯微鏡下進(jìn)行 PKH26標(biāo)記PGCs的計(jì)數(shù).PKH26標(biāo)記細(xì)胞在綠光下呈紅色熒光.

1.2.8 注射外源PGCs后的受體雞胚繼續(xù)孵化至5.5d時(shí)性腺PGCs的分離和計(jì)數(shù) 待上述移植了標(biāo)記PGCs的受體雞胚孵化至5.5d,此時(shí)雞胚大部分發(fā)育至27期.將1對(duì)性腺置于含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(冰浴操作)中,然后置于含250μL 0.02% EDTA的PBS于37℃孵育,15min后用針頭輕輕切割性腺.充分切割后的細(xì)胞懸液加入1.5mL含20%FBS 的DMEM 450×g離心5min.10μL DMEM重懸.混勻,取 5μL,涂片,熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù).

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件采用 SPSS 11.5.資料在統(tǒng)計(jì)分析前均經(jīng)SPSS的Explorer分析,數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差相等.各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,顯著性水平設(shè)置為α＝0.05.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCB 52對(duì)外源PGCs數(shù)量影響

所有受體雞胚注入 PKH26標(biāo)記的外源PGCs,在外源PGCs沿生殖新月－血液循環(huán)－生殖原基遷移的過(guò)程中檢測(cè)其數(shù)量變化.結(jié)果表明(表1),PCB 52處理組的PGCs數(shù)量明顯低于未處理組及等量DMSO處理組,說(shuō)明PCB 52可明顯降低外源PGCs的增殖性遷移(P＜0.05).

表1 PCB52對(duì)PKH26標(biāo)記外源PGCs數(shù)量的影響Table 1 Effect of PCB52 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

2.2 E2對(duì)外源PGCs數(shù)量的影響

為確定PCB 52對(duì)雞胚的影響是否其雌激素作用,特設(shè)立E2處理組(表2),將PKH26標(biāo)記的外源PGCs注入上述3組受體生殖新月,區(qū)域繼續(xù)孵化,檢測(cè)13～15期和27～29期的標(biāo)記PGCs數(shù)量變化.結(jié)果表明,E2對(duì)外源PGCs的增殖性遷移無(wú)明顯影響(P＞0.05).

表2 E2對(duì)PKH26標(biāo)記外源PGCs數(shù)量的影響Table 2 Effect of E2 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中PCB 52的使用劑量采用PCB 52污染地區(qū)鳥類體內(nèi) PCB 52的濃度[12],以便在實(shí)驗(yàn)室條件條件下模擬自然界PCB 52的污染濃度.以往利用雞胚研究污染物的影響時(shí),通常將污染物注射到卵黃或者受精卵氣室,本實(shí)驗(yàn)緊鄰胚盤導(dǎo)入PCB 52,可使PCB 52立即對(duì)PGCs產(chǎn)生影響.因?yàn)殡u胚是典型的端黃卵,如果將外源物質(zhì)注入到氣室或者遠(yuǎn)離胚胎的其他位置,微量外源物質(zhì)難以對(duì)遷移中的PGCs產(chǎn)生作用.

PCB 52被認(rèn)為具有雌激素活性[7].在受PCBs污染地區(qū),從食蟲性鳥類(如大山雀)到食肉性猛禽(如埃及禿鷹)體內(nèi)都可以檢測(cè)到 PCB 52[12].盡管體內(nèi)的PCB 52沒(méi)有對(duì)成年鳥的健康造成明顯損害,但對(duì)其所產(chǎn)卵有明顯影響[12].實(shí)驗(yàn)證明,用PCBs處理未孵化雞胚,對(duì)出殼后的雞胚生殖系統(tǒng)可造成明顯損害,影響其卵子和精子的形成[12-15].鳥類PGCs起源于胚胎外胚層,孵化過(guò)程中不同發(fā)育時(shí)期的PGCs均是在此基礎(chǔ)上通過(guò)增殖性遷移而來(lái).追蹤不同發(fā)育時(shí)期的 PGCs數(shù)量,就可揭示環(huán)境污染物對(duì)PGCs的增殖性遷移影響[8].

本課題組以往的實(shí)驗(yàn)證明,PCB 52可明顯降低原條期明區(qū)和血液中內(nèi)源性PGCs的數(shù)量,并證明PCB 52對(duì)血液中PGCs的影響是由于降低了生殖新月明區(qū)PGCs的緣故[10].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)顯微移植技術(shù),將供體雞胚PGCs用PKH26熒光染料標(biāo)記,然后移植到經(jīng)PCB 52處理的受體雞胚,隨后檢測(cè)發(fā)育至13～15期和27～29期時(shí)的PKH26標(biāo)記的PGCs數(shù)量.結(jié)果表明,PCB 52可明顯降低外源PGCs在血液和性腺中的數(shù)量,說(shuō)明PCB 52對(duì)外源性 PGCs遷移有明顯的阻礙作用.以往實(shí)驗(yàn)[16]和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,E2對(duì)內(nèi)源性及外源性PGCs的增殖性遷移均無(wú)影響.E2對(duì)內(nèi)源和外源PGCs的增殖性遷移無(wú)明顯影響的機(jī)制是否與PGCs膜上的受體表達(dá)有關(guān),或PGCs膜上受體表達(dá)的時(shí)空性等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步探討.E2對(duì)PGCs的遷移無(wú)明顯影響,揭示PCB 52可能影響的是受體性腺的誘引物質(zhì),且這種影響是非雌激素作用.

由于內(nèi)源性 PGCs的消除可明顯提高外源性PGCs移植效率,所以在本實(shí)驗(yàn)中除了用PCB 52和E2處理受體雞胚外,還用白消安進(jìn)行了受體的處理.Song等[17]的研究表明,用白消安處理雞胚盤,能明顯降低內(nèi)源性的PGCs數(shù)量,但對(duì)白消安處理雞胚繼續(xù)孵化20多個(gè)小時(shí)后注入的外源性PGCs的增殖性遷移無(wú)明顯影響.

本實(shí)驗(yàn)所用的PKH26可有選擇地嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)層從而細(xì)胞被染色.PKH26從細(xì)胞溶出的半衰期是100d以上(體內(nèi)),這種特性使得PKH26在生物體內(nèi)的跟蹤研究細(xì)胞時(shí)與其他標(biāo)記物相比,具很大優(yōu)勢(shì).在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)PKH26的跟蹤研究,發(fā)現(xiàn)PCB 52可明顯降低外源PGCs的在血液循環(huán)中和生殖原基中的數(shù)量,這表明 PCB 52在雞胚體內(nèi)的半衰期很長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞的毒性影響最少持續(xù)100多小時(shí),對(duì)胚胎的原始生殖細(xì)胞可造成長(zhǎng)久的有害影響.

4 結(jié)論

4.1 本實(shí)驗(yàn)表明, PCB 52對(duì)外源性PGCs的增殖性遷移有明顯影響.

4.2 E2對(duì)外源性PGCs的增殖性遷移無(wú)明顯影響.

[1] 黃健生,賈曉平,甘居利.珠江口印度洋瓶鼻海豚皮脂的多氯聯(lián)苯研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2007,27(4):461-466.

[2] Clark P F, Mortimer D N, Law R J, et al. Dioxin and PCB contamination in Chinese mitten crabs: human consumption as a control mechanism for an invasive species [J]. Environmental Science and Technology, 2009,43:1624-1629.

[3] Gupta C. Reproductive malformation of the male offspring following maternal exposure to estrogenic chemicals [J]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 2000,224:61-68.

[4] Phillips D I, Barker D J, Fall C H, et al. Elevated plasma cortisol concentrations: a link between low birth weight and the insulin resistance syndrome? [J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1998,83:757-760.

[5] Nielsen M, Bjornsdottir S, Hoyer P E, et al.Ontogeny of oestrogen receptor alpha in gonads and sex ducts of fetal and newborn mice[J]. Journal of Reproduction and Fertility, 2000,118: 195-204.

[6] Iguchi T,Watanabe H, Katsu Y.Application of ecotoxicogenomics for studying endocrine disruption in vertebrates and invertebrates [J]. Environmental Health Perspectives, 2006,114(Suppl 1):101-105.

[7] Pukazhenthi B, Comizzoli P, Travis A J, et al. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species [J]. Reproduction, Fertility and Development, 2006,18:77-90.

[8] Kuwana T, Rogulska T. Migratory mechanisms of chick primordial germ cells toward gonadal anlage [J]. Cellular and Molecular Biology, 1999,45:725-736.

[9] Iona S, Klinger F G, Sisti R, et al. A comparative study of cytotoxic effects of N-ethyl-N-nitrosourea, adriamycin, and mono-(2-etnylnexyl)pnthalate on mouse primordial germ cells [J]. Cell Biology and Toxicology, 2002,18:131-145.

[10] 張易祥,金秀梅,李贊東.四氯聯(lián)苯對(duì)雞胚生殖新月原始生殖細(xì)胞分布的影響 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008,28(11):1325-1328.

[11] Zhao D F, Kuwana T. Purification of avian circulating primordial germ cells by Nycodenz density gradient centrifugation [J]. British Poultry Science, 2003,44:30-35.

[12] Wiesmüller T, Schlatterer B, Wuntke B, et al. PCDDs/PCDFs, coplanar PCBs and PCBs in barn owl eggs from different areas in the state of Brandenburg, Germany [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1999,63:15-24.

[13] 方昌閣,張才喬,夏國(guó)良,等.多氯聯(lián)苯對(duì)雞胚睪丸結(jié)構(gòu)的損傷作用 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2002, 22(2):168-70.

[14] 方昌閣,張才喬,夏國(guó)良,等.多氯聯(lián)苯對(duì)雞胚卵巢發(fā)育和配子分化的影響 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001,6(1):1-5.

[15] 解美娜,張才喬,曾衛(wèi)東,等.多氯聯(lián)苯對(duì)雞胚性腺發(fā)育的毒性和雌性激素作用 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2004,24(3):274-276.

[16] Zhang Y, Jin X, Han H, et al. Effects of 2,2', 5,5'-Tetrachlorobiphenyl on migration of chicken primordial germ cells[J]. Reproduction, Fertility and Development, 2005,17:587-591.

[17] Song Y, D'Costa S, Pardue S L, et al. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion [J]. Molecular Reproduction and Development, 2005,70: 438-444.