王偉琴 ,金永堂 *,吳 斌 ,孫肖瑜 ,龐曉露 ,王 靜 (.浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,環(huán)境醫(yī)學(xué)系,浙江 杭州30058；.浙江省環(huán)境監(jiān)測中心,浙江 杭州 300)

近年來,一些作為飲用水源的湖泊、水庫等水體富營養(yǎng)化及藍(lán)藻水華爆發(fā)已嚴(yán)重威脅到人民群眾的飲用水安全[1].藍(lán)藻水華爆發(fā)不僅造成水質(zhì)下降,而且還釋放出內(nèi)源性藻毒素,其中微囊藻毒素(MC)是出現(xiàn)頻率最高,危害最嚴(yán)重的藻類毒素[2],微囊藻毒素-LR(MC-LR)是我國富營養(yǎng)化水體中毒性較大的常見亞型,能強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶 1(PP1)和蛋白磷酸酶 2A(PP2A)的活性[3],具有肝臟毒性和腫瘤促進(jìn)作用[4].常規(guī)水處理方法不能完全去除水中的 MC[5],為確保居民飲用水安全,迫切需要對MC污染水體的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評價(jià),并提出相應(yīng)的防制措施.目前對水環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)多使用數(shù)學(xué)模型和動物模型[6],盡管對水中污染物的遺傳毒性研究較多,但是對人體可能具有的遠(yuǎn)期健康效應(yīng)的評價(jià)卻較少.本研究對浙江省101個(gè)縣級以上集中式飲用水源水中的176種污染物進(jìn)行了監(jiān)測,結(jié)果顯示MC是其中分布最廣、且非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)最高的污染物.因此,采集 MC污染嚴(yán)重的水源水樣,一部分采用樹脂對其中的藻毒素進(jìn)行濃集,另一部分以水源水稀釋不同濃度的MC-LR純毒素模擬了水中MC不同的污染狀況,檢測與分析了MC對魚的生態(tài)毒性和細(xì)菌致突變性及水源水中不同濃度的 MC對人體DNA損傷的遠(yuǎn)期效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國 Thermo Fisher Scientific公司),DYY-11B型水平電泳儀(北京市六一儀器廠),BX51型熒光顯微鏡及 DP50數(shù)碼攝像頭(日本Olympus公司),水族箱(廣東日生公司),真空過濾系統(tǒng)(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),Autotrace固相萃取儀(美國Zymark公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士 Buchi公司),氮吹儀(美國Organomation公司),Oasis HLB 小柱(6mL、500mg, 美國Waters公司).

MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品(瑞士Alexis公司),純度95%,用色譜級甲醇稀釋為500μg/mL的母液,-20℃保存;正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)、溴化乙錠(EB)、葡萄糖-6-磷酸、2-甲氯基-6氯代-9-[3-(2-氯乙基)氨基丙胺]吖啶-2鹽酸(ICR-191) (美國Sigma);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco);柔毛霉素(Pharmacia Italia S.p.A);2-氨基芴(ALDRICH),其余試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 水樣采集和檢測

2008年5月豐水期,采集了浙江省101個(gè)縣級以上集中式飲用水水源地的地表水樣(水面下0.5m),檢測了水中MC-LR和MC-RR的含量.

太湖是我國第3大淡水湖,是周圍城市重要的飲用水源地,近年來藍(lán)藻污染水體事件常有發(fā)生,于2008年5月豐水期,采集了該流域湖州地區(qū)城北水廠(記為A)和新塘(記為B) 2地水樣.

1.3 水環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

根據(jù)水源地水樣檢測結(jié)果,基于美國EPA推薦的水環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)模型[7]對檢出 MC致癌與非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行綜合評價(jià).水健康風(fēng)險(xiǎn)模型將水環(huán)境污染與人群健康危害聯(lián)系起來,通過收集、整理、解釋各種健康相關(guān)資料,包括毒理學(xué)研究資料、人群流行病學(xué)資料、環(huán)境暴露因素資料,以風(fēng)險(xiǎn)度為指標(biāo)定量描述環(huán)境毒物對健康的影響程度.

1.4 水源水中MC的濃集

根據(jù)水源水樣監(jiān)測結(jié)果,A、B兩水源水中主要的有機(jī)成分為 MC(其中分別含 0.094μg/L MC-LR、0.091μg/L MC-LR),按文獻(xiàn)[8]方法收集樣品,經(jīng) 0.45μm玻璃纖維濾膜過濾去除懸浮顆粒,通過Oasis HLB小柱進(jìn)行固相萃取,甲醇、丙酮、二氯甲烷洗柱,洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、N2吹干,DMSO定容,使得濃集物中MC-LR濃度為4.5μg/mL,-20℃避光保存?zhèn)溆?

1.5 水源水中MC的致突變性

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由浙江省疾病預(yù)防控制中心惠贈,經(jīng)菌株生物學(xué)特性鑒定,均符合實(shí)驗(yàn)要求.采用苯巴比妥和 5′6-苯黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為代謝活化系統(tǒng)(S9),經(jīng) Lowry法蛋白定量檢測符合實(shí)驗(yàn)要求.

按照平板摻入法[9]分別對藻毒素濃集物、藻毒素稀釋水樣及純毒素的致突變性進(jìn)行檢測,以DMSO稀釋水樣濃集物,A、B 2水源水稀釋MC-LR純毒素,各試驗(yàn)組每皿加入不同濃度的藻毒素濃集物和稀釋水樣,使得濃集物和水樣中MC-LR的濃度為0.01,0.10,1.00,10.00,100.00μg/L (不包括水源水中MC-LR本底值),分別記為濃集物A、B和水樣A、B,并以MC-LR純毒素作為標(biāo)準(zhǔn)濃度序列.

在45℃保溫的頂層瓊脂中加入0.1mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1mL受試物,需要活化時(shí)加 10% S9混合液0.4mL,經(jīng)37℃ 5% CO2培養(yǎng)48h,觀察計(jì)數(shù)產(chǎn)生回復(fù)突變的菌落數(shù).每個(gè)樣品做3個(gè)平行皿,同時(shí)設(shè)陰性對照、陽性對照和自發(fā)回變組,重復(fù)試驗(yàn)2次.以受試物的回變菌落數(shù)為自發(fā)回變菌落數(shù)2倍以上,并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者定為陽性.

1.6 水源水中微囊藻毒素的染色體損傷檢測

健康錦鯉(Cyprinus carpiod)購于花鳥市場,體重 25~40g,體長 20cm左右,實(shí)驗(yàn)室水族箱(200L,水溫20~25℃)內(nèi)適應(yīng)1周后用于實(shí)驗(yàn).

參考王維等[10]提出的30h魚背肌染毒法,用微量進(jìn)樣器將受試物(受試物含量與 Ames試驗(yàn)相同)分別按1μL/g的魚體重注射于魚背肌,2次染毒時(shí)間間隔24h,在第2次染毒結(jié)束后6h,進(jìn)行尾靜脈采血,制備血涂片,自然晾干,經(jīng)甲醇固定后Giemsa染色20min.環(huán)磷酰胺(80mg/kg)作為陽性對照,每個(gè)劑量組從 5尾健康錦鯉中隨機(jī)抽取2尾,每尾魚制2張血涂片.每張片子計(jì)數(shù)2000個(gè)清晰完整、染色良好的紅細(xì)胞,顯微鏡下計(jì)數(shù),計(jì)算微核千分率(‰).

微核判斷標(biāo)準(zhǔn):微核位于紅細(xì)胞胞漿中,與主核完全分開,邊緣清晰光滑,染色與主核一致或略淺,大小為主核的1/20~1/3.

1.7 水源水中微囊藻毒素的DNA損傷檢測

常規(guī)方法從健康成年志愿者全血中分離淋巴細(xì)胞,PBS緩沖液制備5×106/mL的細(xì)胞懸液,臺盼藍(lán)測定細(xì)胞存活率.在裝有RPMI 1640培養(yǎng)基的離心管內(nèi)分裝細(xì)胞懸液100μL/管,分別加入10μL 各濃度受試物(受試物含量與 Ames試驗(yàn)相同),陽性對照組加10μL 5mmol/L重鉻酸鉀溶液使得最終濃度為 0.1mmol/L,另作陰性對照組和水源水組,37℃ 5% CO2染毒6h.彗星試驗(yàn)采用2層凝膠法[11],染毒完畢用PBS液洗細(xì)胞2次,以防止毒物繼續(xù)影響,臺盼藍(lán)測定細(xì)胞存活率,進(jìn)行彗星試驗(yàn)檢測,經(jīng)鋪片、堿性解旋、電泳、中和與固定后,40μL EB (20μg/mL)染色,熒光顯微鏡下觀察攝片,每張片子隨機(jī)拍攝100個(gè)細(xì)胞,以細(xì)胞尾部DNA百分比(%)、彗星尾長(μm)、尾矩和Olive尾距綜合反映細(xì)胞DNA損傷情況.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,主要統(tǒng)計(jì)分析方法為Levene檢驗(yàn)、方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 基于EPA模型的水源水健康風(fēng)險(xiǎn)度結(jié)果

101個(gè)縣級以上集中式飲用水源地水樣共檢出MC-LR(13處)、MC-RR(15處),主要分布于湖州、臺州和金華地區(qū),最高檢出濃度下對應(yīng)的個(gè)人年均致癌與非致癌風(fēng)險(xiǎn)如表1所示.MC-LR的個(gè)人非致癌年風(fēng)險(xiǎn)為4.80×10-9,未超過國際輻射防護(hù)委員會(ICRP)推薦的最大可接受風(fēng)險(xiǎn) 5.0× 10-5[12],MC-RR無相應(yīng)參考劑量,其健康風(fēng)險(xiǎn)未予計(jì)算.

表1 基于EPA模型的有機(jī)污染物健康風(fēng)險(xiǎn)度Table 1 Health risk caused by organic pollutants in drinking water source based on EPA model

2.2 水源水中MC的致突變性作用

藻毒素水源水濃集物A、B,藻毒素稀釋水樣A、B及MC-LR純毒素各組致突變結(jié)果如表2、表 3所示,無論是否加入代謝活化系統(tǒng)(S9), TA97、TA98、TA100和TA102各菌株回變菌落數(shù)均高于空白對照組,且存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系,但結(jié)果均未達(dá)到自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍,依據(jù)Ames試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn),藻毒素濃集物、稀釋水樣及純毒素均未顯示出明顯致突變性.

非代謝活化條件下,濃集物A和水樣A多個(gè)劑量組TA97、TA98、TA100菌株,濃集物B和水樣B多個(gè)劑量組TA97、TA98、TA100和TA102菌株回變數(shù)高于同劑量純毒素,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;P<0.05).

代謝活化條件下,各菌株回變數(shù)較非代謝活化條件下有所上升,濃集物A多個(gè)劑量組TA98、TA100菌株回變數(shù)明顯高于同劑量純毒素,水樣A多個(gè)劑量組對TA100菌株回變數(shù)明顯高于同劑量純毒素,水樣 B和 B濃集物多個(gè)劑量組TA98、TA100和TA102菌株回變數(shù)明顯高于同劑量純毒素,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01; P<0.05).

表2 水源水中微囊藻毒素非代謝活化條件下的所致回變菌落數(shù)(個(gè)/皿)Table 2 The number of revertant colonies induced by microcystin without metabolic activation (CFU/dish)

表3 水源水中微囊藻毒素代謝活化條件下的所致回變菌落數(shù)(個(gè)/皿)Table 3 The number of revertant colonies induced by microcystin with metabolic activation (CFU/dish)

2.3 水源水中的MC與染色體損傷效應(yīng)

水源水中微囊藻毒素對錦鯉外周血紅細(xì)胞微核率的影響如表4所示,水源水藻毒素濃集物、藻毒素稀釋水樣及 MC-LR純毒素均可在一定程度上誘導(dǎo)紅細(xì)胞產(chǎn)生微核.藻毒素濃集物、稀釋水樣及純毒素各組錦鯉外周血紅細(xì)胞微核率均高于陰性對照,純毒素最高劑量組(100.00μg/L)微核率達(dá)到 2.37‰±0.62‰,與對照組(0.75‰±0.64‰)相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明該劑量下可誘發(fā)染色體損傷.濃集物A和水樣A多組細(xì)胞微核發(fā)生率高于對照組,最高劑量下(100.00μg/L)微核率分別達(dá)到 2.50‰±1.29‰和3.37‰±1.11‰,與溶劑對照相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).濃集物B和水樣B各組微核率高于水源對照,濃集物 B最高劑量組微核率達(dá)到3.18‰±0.41‰,與溶劑對照相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

2.4 水源水中MC引起的DNA損傷效應(yīng)

水源水中MC對人外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷結(jié)果如圖1、表5所示.染毒前后,對照組和染毒組細(xì)胞存活率均不低于 95%,且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).圖 1A中陰性對照組細(xì)胞呈圓形,無彗尾現(xiàn)象,提示DNA鏈未發(fā)生明顯斷裂;從圖1B~圖1F可以看出各染毒組均出現(xiàn)明顯彗星樣拖尾,表明DNA鏈?zhǔn)軗p發(fā)生斷裂,且隨著染毒劑量的增加損傷逐漸加重,100.00μg/L組細(xì)胞DNA損傷最為嚴(yán)重,圖像表現(xiàn)為熒光信號變小,尾部長且尾部面積大(圖1F).

純毒素各組尾部DNA百分比、尾長、尾矩和 Olive尾矩均高于陰性對照組,最高劑量組DNA百分比為 30.13%±23.94%,尾長為(29.52± 23.70)μm,尾矩和 Olive尾矩分別達(dá)到 13.50± 18.07和8.23±10.06,與對照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明MC-LR可引起人外周血淋巴細(xì)胞DNA鏈斷裂,且DNA損傷各指標(biāo)隨著染毒劑量的增加呈上升趨勢.

水源水藻毒素濃集物 A和濃集物 B各組DNA損傷指標(biāo)均高于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系,最高劑量組(100.00μg/L)尾部DNA百分比、尾長、尾矩和 Olive尾矩等各項(xiàng)指標(biāo)接近陽性對照水平,表明各劑量組濃集物A均可引起細(xì)胞DNA損傷,高劑量染毒條件下?lián)p傷最為嚴(yán)重.

表4 水源水中微囊藻毒素對錦鯉紅細(xì)胞微核率的影響Table 4 Micronuclei induction in carp erythrocytes exposed to microcystin in drinking source water

圖1 MC-LR致人外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷彗星圖像 (EB染色,×400)Fig.1 Comet picture of human lymphocytes exposed to MC-LR (×400)

表5 水源水中微囊藻毒素對人外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的影響Table 5 DNA damage in human peripheral blood lymphocytes exposed microcystin

稀釋水樣A中除0.01μg/L組外,各組DNA損傷指標(biāo)均高于水源對照,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系.其中100.00μg/L組DNA百分比為(22.77±15.67)%,彗星尾長達(dá)到(23.88±14.53)μm,尾矩和 Olive尾矩分別為7.17±7.67和4.81±4.24,表明水樣A中的微囊藻毒素對人外周血淋巴細(xì)胞DNA鏈產(chǎn)生了損傷,且隨著染毒劑量的增加,DNA損傷程度呈現(xiàn)加重的趨勢.稀釋水樣 B 中 1.00,10.00, 100.00μg/L組DNA損傷指標(biāo)均明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系.這表明水樣B中微囊藻毒素引起了淋巴細(xì)胞DNA鏈斷裂,具有DNA損傷能力.

3 討論

對浙江省 101個(gè)縣級以上飲用水源地水樣中的2種MC進(jìn)行監(jiān)測,MC-LR引起的非致癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到4.80×10-8a-1,MC-RR無相關(guān)毒理學(xué)參數(shù),健康風(fēng)險(xiǎn)未予計(jì)算,因此水源水中MC的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)高于計(jì)算值.太湖 MC-LR的濃度較低(0.01~ 0.43μg/L),未超過國家飲用水規(guī)范中 MC-LR低于1.0μg/L的限定標(biāo)準(zhǔn),但藍(lán)藻暴發(fā)時(shí)期水中MC濃度迅速上升,可高達(dá)54.89μg/L[13].

本研究運(yùn)用樹脂對水源水中的 MC進(jìn)行濃集,同時(shí)以水源水為溶劑稀釋MC-LR純品,對天然水體中的不同濃度藻毒素可能存在的遺傳毒性進(jìn)行了檢測,分析了可能存在的健康風(fēng)險(xiǎn).結(jié)果顯示了水源水藻毒素濃集物、稀釋水樣和純毒素各組無論是否加入代謝活化系統(tǒng),對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102各菌株均未呈現(xiàn)致突變能力,這與 Ding等[14]的研究結(jié)果一致.藻毒素濃集物、稀釋水樣與純毒素相比,多個(gè)劑量組回變菌落數(shù)高于純毒素組,猜測水源水濃集過程同時(shí)可能帶入一些有機(jī)物質(zhì),而水源水中除含有藻毒素以外,還可能含有一些其他生物活性成分,本身具有一定的致突變性,或者與藻毒素相互作用增強(qiáng)了致突變性,從而可能導(dǎo)致藻毒素濃集物、稀釋水樣與純毒素在菌株回變數(shù)上的差異.有研究顯示,各個(gè)季節(jié)的太湖水樣Ames試驗(yàn)陽性,可誘導(dǎo)基因突變[15],而宋瑞霞等[16]從太湖藍(lán)藻水華中提取微囊藻毒素顯示可導(dǎo)致TA98菌株發(fā)生移碼突變,考慮可能是由于不同水體中藻群生物性狀的差異,MC構(gòu)型的不同所致.

微核是細(xì)胞有絲分裂后期滯留于胞質(zhì)中的染色體片段或染色單體,主要由于染色體斷裂、非整倍體化形成,是染色體損傷的標(biāo)志之一,目前廣泛用于放射損傷和誘變劑檢測.有研究顯示,MC-LR可以誘發(fā)TK6細(xì)胞、小鼠骨髓細(xì)胞微核率上升[16-17],但是MC對淡水魚類的遺傳毒性的生態(tài)毒理學(xué)研究仍較少.本研究結(jié)果顯示高劑量組濃集物、水樣A和高劑量組的純毒素誘發(fā)淡水魚類紅細(xì)胞微核率增高,可致染色體損傷,對水生生物具有遺傳毒性效應(yīng).

目前對于MC是否具有DNA水平上的遺傳毒性還存在著較大的爭議.研究發(fā)現(xiàn),1mg/L MC-LR可以誘導(dǎo) 20%的人外周血淋巴細(xì)胞DNA發(fā)生明顯損傷[18].而本研究中MC-LR純毒素、濃集物與水樣在彗星試驗(yàn)中各項(xiàng)DNA損傷指標(biāo)均有不同程度上升,顯示了較強(qiáng)的損傷作用,其損傷程度隨著染毒劑量增加而逐步加重,存在良好的劑量反應(yīng)關(guān)系.目前MC-LR引起DNA損傷機(jī)制尚不十分明了,有學(xué)者認(rèn)為 MC-LR導(dǎo)致DNA損傷并不是某個(gè)機(jī)制的單一作用的結(jié)果,氧化應(yīng)激在藻毒素所致的DNA損傷中發(fā)揮重要作用,較短時(shí)間暴露就能檢測到 DNA鏈的斷裂[19-21].有研究者證明MC-LR可干擾DNA的堿基切除修復(fù)[22],這可能是藻毒素的致癌作用的機(jī)制之一,而其表現(xiàn)出的 DNA損傷作用是由早期凋亡引起的.研究發(fā)現(xiàn)caspase-3、p53、bcl-2和Bax在MC-LR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可能具有重要作用[23-24].也有專家認(rèn)為藻毒素可能并不能直接造成 DNA損傷,而是通過抑制其修復(fù)酶的活性所導(dǎo)致的損傷[21].

本研究發(fā)現(xiàn),水源水濃集物及水源水中MC-LR的遺傳毒性與純毒素相比存在一定的差別,Ames試驗(yàn)中水源水濃集物和2地水樣多個(gè)劑量組引起回變菌落數(shù)高于純的藻毒素組,彗星試驗(yàn)中水源水濃集物、水源水樣中MC-LR與純毒素的 DNA損傷作用大小也具有一定的差異,考慮水源水中除藻毒素以外可能還存在其他的有機(jī)毒物,雖然濃度較低,也可能產(chǎn)生一定的遺傳毒性效應(yīng),仍需進(jìn)一步深入研究.

4 結(jié)論

4.1 浙江省 101個(gè)縣級以上飲用水源水中MC-LR引起的非致癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到4.80×10-9a-1,未超過ICRP推薦的最大可接受水平(5.0×10-5a-1).

4.2 在本研究條件下,水源水MC濃集物及MC稀釋水樣可誘導(dǎo)鯉魚紅細(xì)胞微核率上升,引發(fā)人外周血淋巴細(xì)胞 DNA損傷,具有一定的遺傳毒性,尚未觀察到具有致Ames試驗(yàn)陽性的能力,對人體健康存在潛在威脅.

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