田 允 蔡 晶 陳旭征 林如輝 劉志臻 趙錦燕

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補腎中藥對帕金森病模型小鼠黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元的保護作用*

田 允 蔡 晶 陳旭征 林如輝 劉志臻 趙錦燕

福建中醫(yī)藥大學，福建中西醫(yī)結(jié)合研究院

帕金森病(Parkinson’s disease)是常見于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，隨著人口的老齡化，本病的發(fā)病率正在逐年遞增，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)理論有腎主骨生髓，腦為髓之海，因此可以通過滋補腎臟來補益腦髓，現(xiàn)代研究也表明：以補腎為主的方藥可延緩PD過程，改善 PD患者的生活質(zhì)量。本實驗通過對PD模型小鼠神經(jīng)凋亡因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測探討補腎中藥治療PD的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7周齡SPF級C57BL/6J品系雄性小鼠90只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（合格證號：SCXK(瀘)2007-0005），體重20±2g。置于福建中醫(yī)藥研究院實驗動物中心SPF級動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)并建造模型，室溫20-22℃。小鼠全價顆粒飼料由建中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供。

1.2 藥品、試劑與儀器

淫羊藿，小檗科箭葉淫羊藿的地上部分，產(chǎn)地四川；女貞子，木犀科女貞的干燥成熟果實，產(chǎn)地浙江；黃精，百合科多年生草本植物黃精的根莖，產(chǎn)地河北；司來吉蘭，南京思科藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，5m*10。以上藥品均由福建醫(yī)藥集團提供。

淫羊藿、女貞子、黃精經(jīng)福建中醫(yī)學院藥學系楊成梓副教授鑒定，并經(jīng)福建中醫(yī)學院中藥生藥學實驗室測定：紫外分光光度法測定淫羊藿中總黃酮以淫羊藿苷計得率為12.4%、黃精中黃精多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計，得率為13.2％；HPLC法測定女貞子中齊墩果酸和淫羊藿中淫羊藿苷分別為1.37%和2.67％。證實原材料符合10版藥典的質(zhì)量標準，可用于進一步實驗研究。

1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽（MPTP·HCl），訂購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；FasL抗體、FasL抗體同型對照、Fas抗體、Fas抗體同型對照、Caspase-3試劑盒、Caspase-3抗體同型對照及Bcl-2試劑盒均由美國BD公提供；小鼠NGF、BDNF、GDNF的ELISA試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

主要實驗儀器：多功能小鼠自主活動記錄儀（YLS-1A，淮北正華）、小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀（YLS-4C，淮北正華）、透射電鏡（H7650，日本日立公司）、流式細胞儀（Facscalibur，美國BD公司）、全自動酶標儀（XL800，美國Bioteck公司）。

1.3 帕金森病模型的制備、小鼠分組及給藥

C57BL/6J品系雄性小鼠腹腔注射MPTP·HCl， 25mg/(kg·d)，1次/2天，連續(xù)18次。每次注射后至少4h后檢測小鼠的自主活動次數(shù)和轉(zhuǎn)棒時間，最后一次檢測后統(tǒng)計分析小鼠的活動情況，選自主活動次數(shù)和轉(zhuǎn)棒時間均下降小鼠為造模成功小鼠。

取正常11周齡SPF級C57BL/6J品系雄性小鼠8只作為正常對照組，取40只造模成功的小鼠隨機分為淫羊藿組、女貞子組、黃精組、司來吉蘭組及模型對照組5組，每組8只。淫羊藿組、女貞子組、黃精組、司來吉蘭組分別灌胃給予淫羊藿女貞子、黃精、司來吉蘭的水煎液及水溶液，正常對照組及模型對照組均給予蒸餾水。每次灌胃0.5mL，每天2次，連續(xù)給藥4周，每天給藥時間為8:00和16:00。淫羊藿、女貞子、黃精、司來吉蘭劑量分別為6g/kg/d、6g/kg/d、8g/kg/d、2mg/kg/d，相當于成人常用量。

1.4 藥物制備

分別稱取淫羊藿36g、女貞子36g、黃精48g加入600ml的蒸餾水中，浸泡60min后,煎煮300mL藥液，藥液濃度分別為120mg/ml、120mg/ml、160mg/ml，過濾后裝瓶密封消毒, 4℃冷藏備用。

司來吉蘭12mg，用雙蒸水溶解配制成300mL的水溶液，藥液濃度為0.04 mg/ml，裝瓶密封消毒, 4℃冷藏備用。

1.5 標本采集及觀察項目

給藥后小鼠每組取7只快速脫頸椎處死，用眼科剪開顱迅速取腦。生理鹽水沖洗去除大腦皮層表面的脂肪組織。參考《The Mouse Brain》[14]及《大鼠腦立體定位圖譜》[15]在冰浴中切取黑質(zhì)-紋狀體。小鼠右側(cè)的黑質(zhì)-紋狀體用眼科剪剪成糊狀加PBS，以200目的尼龍網(wǎng)濾成單細胞液體，離心去上清，加PBS混勻并調(diào)整細胞濃度為1×106/mL單細胞懸液流式檢測Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2；左側(cè)黑質(zhì)-紋狀體0.1g組織加入生理鹽水1mL的比例勻漿取上清ELISA法檢測NGF、BDNF、GDNF。每組1只小鼠快速脫頸椎處死，用眼科剪開顱迅速取腦。生理鹽水沖洗去除大腦皮層表面的脂肪組織。參考《The Mouse Brain》[14]及《大鼠腦立體定位圖譜》[15]在冰浴中切取黑質(zhì)，置于電鏡固定液中送檢。

1.6 流式檢測Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2

取黑質(zhì)-紋狀體單細胞懸液100μL加5μL抗體或抗體同型對照渦旋混勻，室溫避光保存15min；然后加PBS 2mL，1000rpm離心5min；棄上清，加PBS 500μL重懸后上機檢測。

1.7 ELISA檢測NGF、BDNF、GDNF

取黑質(zhì)-紋狀體勻漿上清100μL加入酶標版孔中，加待檢抗原，37℃孵育30min，洗滌3次、拋干；加抗體，37℃孵育30min，洗滌3次、拋干；加底物液，37℃孵育15min，加終止液；全自動酶標儀測定其OD值。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)在Microsoft Windows XP系統(tǒng)下采用SPSS13.0進行處理。檢測結(jié)果用±表示。用藥后組間數(shù)值比較，用完全隨機設計的單因素方差分析，組間差異的多重分析用LSD或Games-Howell法。檢驗水準=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠用藥后Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2含量比較結(jié)果

淫羊藿組和女貞子組FasL的含量與空白對照組、司來吉蘭組及模型對照組無明顯差異（＞0.05）；黃精組FasL的含量明顯低于模型對照組（＜0.05），與司來吉蘭組及空白對照組無明顯差異（＞0.05）。淫羊藿組、女貞子組和黃精組的Fas的含量與空白對照組、司來吉蘭組及模型對照組無明顯差異（＞0.05）。淫羊藿組、女貞子組及黃精組的Caspase-3的含量均低于模型對照組（＜0.05），均與空白對照組和司來吉蘭組無明顯差異（＞0.05）。淫羊藿組、女貞子組和黃精組Bcl-2含量均與空白對照組、司來吉蘭組及模型對照組沒有顯著差異（＞0.05）（見表1、圖3）。

表1 各組小鼠用藥后神經(jīng)相關凋亡因子的水平

*與空白對照相比較，<0.05；#與模型對照相比較,<0

2.2 各組小鼠用藥后NGF、BDNF、GDNF含量比較結(jié)果

黃精組中NGF的含量明顯高于模型對照組、司來吉蘭組（＜0.05），與空白對照組無明顯差異（＞0.05）；淫羊藿組和女貞子組中NGF的含量與模型對照組和司來吉蘭組均無明顯差異（＞0.05）。淫羊藿組和黃精組中的BDNF的含量均高于模型對照組和空白對照組（＜0.05），淫羊藿組與司來吉蘭組無明顯差異（＞0.05），黃精組明顯高于司來吉蘭組（＜0.05）；女貞子組中BDNF的含量與空白對照組、司來吉蘭組和模型對照組均無明顯差異（＞0.05）。淫羊藿子、女貞子組和黃精組中GDNF的含量與空白對照組、司來吉蘭組和模型對照組均無差異（＞0.05）（見表2、圖4）。

表 2 各組小鼠用藥后神經(jīng)相關保護因子的OD值

*與空白對照相比較，<0.05；#與模型對照相比較，<0.05；△與司來吉蘭相比較，<0.05

2.3 各組小鼠用藥后黑質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)變化

正常對照組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元電鏡下觀察到胞膜和細胞器完整，線粒體、高爾基復合體豐富，有少量溶酶體，染色質(zhì)散在于核的中部，著色淺；模型組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元在電鏡下則觀察到胞體縮小，核漿比例縮小，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈空泡狀等凋亡表現(xiàn)；淫羊藿組、女貞子組及黃精組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元核內(nèi)胞核固縮及染色質(zhì)邊聚表現(xiàn)較模型組有減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張狀態(tài)不明顯，溶酶體含量較多（見圖5）。

3 討論

帕金森病的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元的變性、丟失。大量的研究表明凋亡參與了PD多巴胺能神經(jīng)元的變性、缺失。PD患者DA能神經(jīng)元的凋亡除了有形態(tài)學上的改變，還有研究證明凋亡因子也參與了多巴胺神經(jīng)元的變性、缺失，在PD患者活檢的黑質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)激活的Caspase-1、3、8、9等的比例高于正常對照組，相關凋亡因子P53、CD95、Bax-XL的表達也增高。此外在MPTP誘導的PD小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)C-Jun、BaxmRNA的表達上調(diào)，而凋亡抑制因子Bcl-2的表達下調(diào)[30-34]。而且細胞凋亡主要是通過caspases家族降解底物蛋白誘導的，因此，阻斷Caspases的激活成為治療PD，阻止其病情發(fā)展的重要途徑。有研究表明補肝腎、補脾腎的單味藥及方劑都可以上調(diào)實驗動物腦中Bcl-2的表達、降低Caspases-3、Fas及FasL的表達，從而減少神經(jīng)元的凋亡[39-42]。本實驗中淫羊藿、女貞子可以降低PD模型小鼠腦黑質(zhì)-紋狀體中Caspase-3的含量；黃精可以降低PD模型小鼠腦黑質(zhì)-紋狀體中Caspase-3、FasL的含量；淫羊藿、女貞子和黃精對抗凋亡因子Bcl-2均沒有明顯的作用。與以往補益中藥可以下調(diào)模型動物Caspases-3、FasL的的含量一致。

神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)是一類由神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織或膠質(zhì)細胞產(chǎn)生并分泌的小分子多肽或蛋白質(zhì),它們通過與其相應受體結(jié)合而啟動效應神經(jīng)元存活、生長、分化,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生理功能維持中起著重要作用。其中NGF、BDNF、GDNF在中腦能促進多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育、分化和存活并在多巴胺神經(jīng)元神經(jīng)損傷后再修復過程中發(fā)揮重要作用[57-59]，是治療PD最具潛力且副作用較小的治療藥物，但NGF、BDNF、GDNF作為蛋白大分子，難以通過血腦屏障，使其臨床應用受到限制。如何促進內(nèi)源性的神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，已成為治療神經(jīng)退行性病變的新的研究途徑?，F(xiàn)代臨床研究也表明培補肝腎類方藥對改善PD的癥狀具有良好的療效[60]。本實驗中淫羊藿可以升高PD模型小鼠腦黑質(zhì)-紋狀體中BDNF的內(nèi)源性含量；黃精也可以增加PD模型小鼠腦黑質(zhì)-紋狀體中BDNF、NGF的內(nèi)源性含量，黃精上調(diào)BDNF的程度可以使腦內(nèi)BDNF的含量超過正常水平；女貞子則對PD模型小鼠腦黑質(zhì)-紋狀體中內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子沒有明顯作用。補腎方藥對帕金森患者的療效可能通過提高腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量起作用的。

中醫(yī)經(jīng)典著作雖無“ 帕金森病”一名，但在《內(nèi)經(jīng)》、《中藏經(jīng)》等中醫(yī)經(jīng)典著作中已有對震顫、強直、姿勢障礙、運動麻痹、慌張步態(tài)等帕金森病的癥狀及病機論述?！秲?nèi)經(jīng)》認為“腎虛髓空為發(fā)病之本”。王肯堂在《證治準繩》中記載：“此病壯年鮮，中年以后乃有之”。帕金森病主要表現(xiàn)為肢體活動失調(diào)，且發(fā)病年齡在進入腎氣衰退的中老年時期，故腎虛髓空是導致帕金森病發(fā)生的內(nèi)在條件，補腎益髓是治療帕金森病的重要方法。臨床研究也證實：以補腎為主的方藥對PD患者的療效顯著，可以有效緩解PD臨床癥狀，減緩PD的病情進展。本實驗證實補腎中藥可以降低PD模型小鼠黑質(zhì)-紋狀體中相關凋亡因子的含量、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量，而電鏡下觀察到得結(jié)果表明給藥后DA能神經(jīng)元的凋亡程度有所減輕。補腎中藥可能通過降低黑質(zhì)-紋狀體中相關凋亡因子的含量、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量來改善DA神經(jīng)元的凋亡，從而達到改善PD臨床癥狀、延緩PD進展的療效的。

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*本文受福建省自然基金項目資助(2009J06016)。

蔡晶，E-mail：caijl＠163.com。