楊秀惠 嚴(yán)延生

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腸道病毒71型（EV71）感染性克隆的構(gòu)建

楊秀惠 嚴(yán)延生

福建省疾病預(yù)防控制中心

腸道病毒71是小RNA病毒科腸道病毒屬中的一員，常在嬰幼兒中引起手足口病的大范圍爆發(fā)流行，并能導(dǎo)致重癥、甚至死亡病例的發(fā)生。1998年中國臺灣地區(qū)129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起[1]，2008年和2009年以EV71感染為主引起的手足口病在中國大陸多個省市流行，并導(dǎo)致479名兒童死亡[2]。這些手足口病疫情使越來越多的研究針對EV71致病機(jī)制、病毒變異與毒力以及疫苗開發(fā)。

反向遺傳技術(shù)為在DNA水平上對RNA病毒進(jìn)行研究和操作提供了極為方便有用的工具。本研究構(gòu)建了EV71全長cDNA克隆,并將體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞,成功獲得拯救病毒，為進(jìn)一步研究EV71病毒基因功能、基因變異與病毒毒力關(guān)系、基因疫苗等研究以及防控該病奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株與細(xì)胞

EV71病毒株FJ08149是2008年從一手足口病病例皰疹液分離獲得，經(jīng)鑒定為EV71 C4基因亞型。RD細(xì)胞由中國疾病預(yù)防控制中心脊灰實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑

長片段擴(kuò)增Primescript RT-PCR Kit購自Takara公司；PCR-XL- TOPO TA載體 購自Invitrogen公司；RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 購自Promega 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 購自Qiagen公司；EV71單克隆抗體購自Chemicon公司；FITC標(biāo)記的二抗購自Dako公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)FJ08149株的序列和酶切位點,設(shè)計了一對引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7啟動子序列及I酶切位點，下游引物EV71-3RM在其5'端引入52個Poly(T)及I酶切位點。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑說明提取病毒RNA,最后用適量無RNA酶的雙蒸水溶解。根據(jù)長片段Primescript RT-PCR Kit說明書，先以EV71-3RM為反轉(zhuǎn)錄引物，在42℃反應(yīng)1小時反轉(zhuǎn)錄全長cDNA，然后利用Takara Ex Taq HS進(jìn)行基因組全長擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min；98℃ 10sec , 68℃ 9min，40個循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖中電泳進(jìn)行檢驗。

1.4 全長cDNA 的構(gòu)建與鑒定

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后純化，以TA克隆方法將帶有T7啟動子識別序列的基因組全長連入TOPO-XL-PCR載體中，用I和I酶切鑒定是否插入目的片段。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞

用Ⅰ和I將有目的片段插入的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切線性化，純化后按照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明在體外轉(zhuǎn)錄出RNA，用RNeasy mini kit（Qiagen）試劑盒進(jìn)行RNA純化后,加30ul無RNA酶的雙蒸水洗脫, 定量。按照Transfection reagent說明書要求把RNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)于6孔細(xì)胞板RD細(xì)胞中, RNA含量為2μg/孔。轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到75%及以上或觀察7天后，收獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定與傳代。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 RT-PCR鑒定及VP1序列測定

用EV71－S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)診斷引物對拯救病毒進(jìn)行鑒定。應(yīng)用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)擴(kuò)增包括VP1全長在內(nèi)的1082bp產(chǎn)物，并進(jìn)行序列測定分析。

1.6.2間接免疫熒光試驗鑒定

CPE達(dá)到75%及以上或觀察7天后，收集細(xì)胞及上清，2500rpm離心10min，取細(xì)胞沉淀用無菌PBS洗2次后，重懸細(xì)胞沉淀，滴加到熒光片，用丙酮將其固定，蒸鎦水清洗1次后加入EV71單克隆抗體，37℃濕盒中孵育1 h，PBS 洗滌3次。加入用1∶6000伊文斯蘭以1∶40 稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗，37℃濕盒中孵育1h，PBS洗滌3 次后甘油封孔，鏡檢。

1.6.3拯救病毒效價測定

獲得拯救病毒經(jīng)RD細(xì)胞傳一代擴(kuò)增后，與母本病毒同時進(jìn)行TCID50測定。詳細(xì)方法及步驟參見《WHO脊髓灰質(zhì)炎病毒實驗室手冊》[3]。

1.6.4電鏡觀察

獲得拯救病毒經(jīng)RD細(xì)胞傳一代擴(kuò)增后，反復(fù)凍融3 次，4500r/min 離心30 min，取上清濃縮5倍后，以1%加入EV71特異性抗體37 ℃孵育2h后，4℃過夜，10000r/min離心30 min，以PBS重懸沉淀，點樣、負(fù)染，電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 全長cDNA克隆的構(gòu)建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM，從FJ08149病毒上清擴(kuò)增出EV71基因組全長約7.5kb，見圖1A（marker不夠清晰）。應(yīng)用TA克隆技術(shù)，將EV71基因組全長連接入PCR-XL-TOPO TA載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)I和I雙酶切鑒定，F(xiàn)J08149T5和FJ08149T25兩個克隆質(zhì)粒均有目的基因插入，見圖1B,目的基因約7.5kb，載體大小為3.5kb。

A: FJ08149株基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 體外轉(zhuǎn)錄制備感染性RNA

應(yīng)用I和I雙酶切，從pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆質(zhì)粒中切下含有T7啟動子的基因組DNA。并將此片段作為體外轉(zhuǎn)錄模板，通過T7 RNA聚合酶系統(tǒng)，體外轉(zhuǎn)錄成RNA，經(jīng)電泳鑒定，轉(zhuǎn)錄的RNA達(dá)到預(yù)期的7.5Kb大小，見圖2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

2.3 病毒的拯救

轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后72小時，即可見到典型的腸道病毒CPE，見圖3A，CPE呈逐日增多，7天后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清以20%比例傳代，第3天CPE達(dá)到75%以上。對照細(xì)胞培養(yǎng)7天均仍保持正常形態(tài)，見圖3B。

A.轉(zhuǎn)染pFJ08149T5后的RD細(xì)胞 B. 正常的RD細(xì)胞

2.4 拯救病毒的鑒定

2.4.1間接免疫熒光鑒定

拯救病毒、拯救病毒傳1代后和母本病毒株用EV71單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測，均可見到特異性的熒光，見圖4A，而細(xì)胞對照無熒光產(chǎn)生，見圖4B。

圖4 拯救病毒的間接免疫熒光鑒定

2.4.2RT-PCR鑒定及序列分析

拯救病毒培養(yǎng)上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R進(jìn)行擴(kuò)增，均得到預(yù)期大小的目的片段，約226bp和1082bp，見圖5。將VP1全長序列測定分析，拯救病毒與母本病毒891個堿基完全一致。

圖5 拯救病毒的RT-PCR鑒定

2.4.3拯救病毒毒力效價測定

將拯救病毒與母本病毒同時進(jìn)行病毒效價測定，結(jié)果pFJ08149T5的效價為105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效價為107.25TCID50/0.1mL，母本病毒FJ08149的效價為107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25與母本病毒對細(xì)胞的感染力相近，而pFJ08149T5約低100倍。

2.4.4病毒粒子的形態(tài)

濃縮后的FJ08149T5拯救病毒與EV71抗體作用后，形成免疫復(fù)合物，經(jīng)負(fù)染色，電鏡下觀察到球形病毒粒子，直徑約22nm，見圖6。

圖6 拯救病毒的免疫電鏡

3 討論

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功拯救出脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）后[4]，翻開了RNA病毒研究的新篇章，實現(xiàn)了在DNA水平上研究RNA病毒。通過構(gòu)建cDNA感染性克隆，應(yīng)用DNA基因操作方法，如定點突變、重組、缺失和嵌合等手段，研究拯救病毒基因水平的改變對表型的影響，進(jìn)而達(dá)到對病毒基因功能與結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制、表達(dá)調(diào)控、分子免疫機(jī)理等的全面認(rèn)識，開發(fā)出新型疫苗。日本學(xué)者Arita等，于2005年首先構(gòu)建了EV71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr的感染性克隆，然后利用基因置換，引入PV疫苗株（Sabin I）影響溫度敏感與病毒毒力的突變位點，在猴子模型上證實了溫度敏感的病毒株對猴子毒性減弱[5]；2008年，他們又在NOD/SCID鼠模型中證實了幾個決定溫度敏感的突變位點在神經(jīng)毒力減弱中起協(xié)同作用[6]。2008年以來EV71在中國大陸流行，迫切需要利用本土流行株構(gòu)建感染性克隆，為研究其致病機(jī)理、病毒變異與毒力關(guān)系以及疫苗的研究提供技術(shù)支持。

由于PV等小RNA病毒的基因組是單股正鏈RNA分子，裸RNA分子就具有感染性，且基因組較小，如EV71等腸道病毒屬僅有7.5Kb大小，無帽子結(jié)構(gòu)。理論上構(gòu)建其感染性克隆可能較為容易，但在實際操作中仍然面臨著不少的困難。首先需獲得完整基因組的cDNA序列，先前基本上采取分段擴(kuò)增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列，操作過程煩瑣，且多次克隆、連接也給基因序列突變增加了機(jī)率。本研究中通過長片段RT-PCR一次性擴(kuò)增出全長基因組，一次克隆操作以盡量減少可能引入序列變異。第二，基因組3’端需有足夠長的Poly(A)尾，一定長度的Poly(A)對維持基因組穩(wěn)定性及保證其感染性均有作用[7]。據(jù)報道，PV的Poly(A)如果少于20個，RNA的感染性比野生株會低20倍[8]。Sarnow等對3’端Poly(A)組成不同對PV體外轉(zhuǎn)錄本感染性影響的研究得到，Poly(A)尾越長其感染性越接近野生株，但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究設(shè)計時利用3’端引物直接帶入52個Poly(A)尾和一個I酶切位點，達(dá)到保證感染性同時可進(jìn)行線性化的目的。第三，保證基因組忠實性，減少其它非基因組序列引入。本研究直接將T7啟動子特異性識別序列通過引物精確加到基因組5’端，并帶入I酶切位點，轉(zhuǎn)錄前通過雙酶切，避免將載體序列引入。第四，克隆擴(kuò)增時如何避免因細(xì)菌增殖可能引起的序列變異，導(dǎo)致序列缺失或插入從而導(dǎo)致基因組序列不完整性。在本研究過程中也曾發(fā)現(xiàn)過類似的情況，因此采用了28℃、150rpm/min的低溫低轉(zhuǎn)速的優(yōu)化培養(yǎng)條件，這是乙型腦炎病毒等其它感染性克隆構(gòu)建過程也曾采取的措施[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)如果基因組正向插入到載體T7啟動子下游，不僅細(xì)菌增殖緩慢且量少，質(zhì)粒拷貝數(shù)低，且轉(zhuǎn)染也無感染性；而如果基因組以反向插入，則細(xì)菌不僅增殖快量大，質(zhì)?？截悢?shù)高，且所獲得的幾株感染性克隆均為此反向插入的。這是否因不同方向插入時，潛在表達(dá)的蛋白質(zhì)不同導(dǎo)致的，有待于進(jìn)一步深入研究分析。

本研究應(yīng)用本地分離株成功地構(gòu)建了中國大陸流行C4基因亞型EV71感染性克隆，轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞成功獲得了拯救病毒，經(jīng)鑒定與野生株具有相似的遺傳特性與生物學(xué)性狀。此感染性克隆構(gòu)建成功，可為下游研究提供了技術(shù)支持。

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291–293.

[2] http://www.chinacdc.net.cn/n272442/n272530/n272757/appendix/doc7307.doc

[3] 世界衛(wèi)生組織.脊髓灰質(zhì)炎實驗室手冊[R].第4版.中國疾病預(yù)防控制中心：北京, 2004：78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981，214(11)：916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005，86：1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008，82(4)：1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989， 63(1)：467-470.

[8] Spector DH，Baltimore D. Requirement of 3'-terminal poly(adenylic acid) for the infectivity of poliovirus RNA.Proc Natl Acad Sci，1974，71：2983-2987.

[9] 黃鶯,賈麗麗,孫志偉,等.流行性乙型腦炎病毒(JEV)全長感染性克隆的制備及恢復(fù)病毒的獲得[J].病毒學(xué)報，2003，19（4）：313-319.