吳守麗 顏蘋蘋 黃海龍 王惠榕 嚴(yán)延生

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福建省分離的HIV-1 Thai-B亞型感染性克隆的構(gòu)建及序列分析

吳守麗 顏蘋蘋 黃海龍 王惠榕 嚴(yán)延生

福建省疾病預(yù)防控制中心

中國自1985年出現(xiàn)第一例艾滋病病人以來[1]，20多年來艾滋病流行經(jīng)歷了傳入期、播散期和快速增長期三個階段，全國 31 個省、市、自治區(qū)均有病例報告。截至2009年底，估計中國目前存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）約74萬人。最新的分子流調(diào)結(jié)果顯示，我國目前流行的主要毒株是Thai-B(44%)，C（29%，主要為 CRF08_BC）和 CRF01_AE (13%)其中 CRF07_BC 和 CRF08_BC 是中國特有的流行毒株，是由 Thai-B 亞型和C 亞型重組而成，而且 Thai-B 亞型已經(jīng)取代了歐美 B 亞型（prototype B）成為我國流行率最高的病毒亞型[2-4]。Thai-B亞型最早是發(fā)現(xiàn)于泰國曼谷的靜脈吸毒人群，與歐美B亞型相比，兩亞型的膜區(qū)序列聚集在一起，可是又位于不同的進(jìn)化樹分支上，故又被命名為Thai-B亞型，其主要特征是在Env基因的V3 loop區(qū)存在14（I-L）、22（F-W）和28（D-Q）的氨基酸置換[5]。目前該亞型除了在泰國傳播流行外，還在亞洲其他國家如中國，馬來西亞，日本等地傳播并成為當(dāng)?shù)氐闹饕餍卸局辍?/p>

自1986年Adachi 通過噬菌體克隆首次獲得HIV的感染性克隆pNL4-3成功構(gòu)建以來[6]，感染性克隆構(gòu)建技術(shù)得到不斷的完善，迄今為止，構(gòu)建成功的感染性克隆已經(jīng)涵蓋數(shù)種亞型，包括A,B,Thai-B, C,D,O,AG,AE,BC,D/C等亞型[7-20]，其中絕大部分是流行于歐美的B亞型毒株。在針對流行于中國的HIV-1病毒構(gòu)建的感染性克隆研究中，有報告的僅有2株，其中1株來自新疆靜脈吸毒人群中的病毒，為CRF07_BC重組亞型[20]，另1株是來自河南賣血人群中的病毒，為Thai-B亞型[10]。這兩毒株來源均具有獨特的區(qū)域代表性。為了進(jìn)一步了解Thai-B亞型毒株的一些生物學(xué)特性及該亞型在福建省可能的傳播途徑，也為構(gòu)建表型耐藥檢測提供必要研究工具，我們在前期研究基礎(chǔ)上選取一株可持續(xù)傳代、快/高復(fù)制、T細(xì)胞噬性的合胞體誘導(dǎo)株進(jìn)行全長基因組序列分析，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建感染性克隆。

1 材料與方法

1.1 毒株來源

由福建省疾病預(yù)防控制中心確認(rèn)并分離的HIV-1毒株lwj，該毒株分離于一名患隱球菌性腦膜炎的艾滋病患者，自稱是經(jīng)輸血/血制品感染。經(jīng)異源雙鏈泳動分析及小片段DNA序列測定鑒定為Thai-B亞型，該毒株可以在原代人PBMCs和傳代人T淋巴細(xì)胞系（MT4）上復(fù)制并導(dǎo)致細(xì)胞病變（CPE），為可持續(xù)傳代、快/高復(fù)制、T細(xì)胞噬性的SI毒株[21]。

1.2 plwj全長基因組克隆的構(gòu)建

用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)提取病毒感染細(xì)胞中基因組DNA。根據(jù)參考序列設(shè)計兩對前后半長引物，應(yīng)用Expand long template PCR system ( Roche)，使用熱啟動技術(shù)進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增，5’前半長片段擴(kuò)增引物是：5’-LTR (5’-TGGATGGGCTAATTTACTCCAAGAAAAGACAAG-3’) 和Half-vif (5’-CCTTTTCTCCTGTCTGCAGACCCCAATATG-3’)，其擴(kuò)增區(qū)域為5’LTR到 vif 約5.2kb；3’后半長片段擴(kuò)增引物是：Halfs-wai (5' CGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACC 3')和 3’-LTR5’-TGCTAGAGATTTTTACTCAGTCTAGAG(TGGT CTGAG-3’)，其擴(kuò)增區(qū)域為vif 到 3’LTR約4.8kb，其前后半長在vif區(qū)有部分重疊。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 2 min，1 個循環(huán)；94℃ 10 sec，57℃ 30 sec，68℃ 5 min50 sec，10 個循環(huán)；94℃ 15 sec，57℃ 30 sec，68℃ 5 min 50 sec，20個循環(huán)，每個循環(huán)遞增5 sec的延伸時間；68℃ 10 min。采用特殊的凝膠純化試劑（結(jié)晶紫），混合3次擴(kuò)增樣品在可見光下進(jìn)行切膠純化。用TOPO XL PCR Cloning Kit（Invitrogen）試劑盒，將lwj前后半長PCR 純化產(chǎn)物克隆到pCR-XL-TOPO T載體上，構(gòu)建plwj-5’half 和plwj-3’half前后半長重組質(zhì)粒。采用PCR 法對轉(zhuǎn)化獲得的單菌落進(jìn)行快速篩選，挑出陽性克隆并進(jìn)一步酶切和 DNA測序鑒定。對前后半長基因序列進(jìn)行酶切圖譜分析，在前后半長Vif重疊區(qū)域找到I單一酶切位點，并利用載體上多克隆位點處限制性內(nèi)切酶I，分別酶切plwj前后半長重組質(zhì)粒，用 T4 DNA 連接酶將酶切后的lwj-3’half片段與plwj-5’half 載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌。采用菌落PCR 法進(jìn)行快速鑒定挑出陽性克隆并進(jìn)一步用I/I雙酶切鑒定以篩選出正確的全基因組克隆，整個克隆構(gòu)建策略見圖1。

圖1 plwj全長基因組克隆構(gòu)建策略

1.3 plwj全基因組克隆轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞產(chǎn)生衍生病毒

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將陽性克隆plwj轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72h后,離心，轉(zhuǎn)染上清經(jīng) 0.45-μm過濾后進(jìn)行 HIV-1 p24抗原檢測（Vironostika HIV-1 Antigen P24 Micro-ELISA System），以確定有無產(chǎn)生衍生病毒。

1.4 plwj全基因組克隆感染活性的鑒定

plwj全基因組克隆轉(zhuǎn)染上清（即衍生病毒）經(jīng)0.45-μm過濾后用 p24 定量檢測試劑盒定量至 80ng/ml病毒，用 1.5ml 的病毒上清感染 3×106經(jīng)PHA-P 刺激活化的正常 PBMCs，孵育 4-5h，離心棄上清，細(xì)胞用 10ml Hank’s 洗兩次后吸干上清以去除殘留的 p24 抗原。用 8ml 新鮮的T淋巴細(xì)胞生長液重懸細(xì)胞后置 37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)12d，每隔3-4d 移去4 ml培養(yǎng)上清液，隨之補(bǔ)充4 ml新鮮的培養(yǎng)液，其中在第6d 補(bǔ)充3×106個經(jīng)PHA-P激活了的正常的PBMCs。收集感染上清進(jìn)行 p24 抗原檢測鑒定衍生病毒對 PBMCs的感染性。以上轉(zhuǎn)染及感染實驗在同等條件下重復(fù)兩次。

1.5 感染性克隆plwj全基因組序列分析

將感染性克隆plwj送交上海生工進(jìn)行測序，使用Primer walking方法進(jìn)行全基因組測序。將全長序列提交HIV databases 庫，利用其Sequence locator Tool進(jìn)行序列定位。測得的序列用DNA STAR軟件進(jìn)行編輯、校正后，使用clustal X軟件與HIV-1M組各亞型參考毒株序列進(jìn)行多重排列、比較和同源性分析；用Bioedit軟件將序列長度編輯一致并進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換后，利用Mega軟件中neighbor-joining(N-J)method進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹的可靠性使用Bootstrap分析，重復(fù)1000次。利用RIP 3.0軟件進(jìn)行序列重組分析。整理后的序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu)，利用該網(wǎng)站提供的耐藥序列分析軟件HIVdb進(jìn)行分析，尋找耐藥相關(guān)突變。

2 結(jié)果

2.1 plwj全長基因組克隆的構(gòu)建及鑒定

應(yīng)用長鏈PCR技術(shù)將plwj全長基因組分5’和3’前后半長進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖 2 ，5’前半長約為 5.2kb，3’后半長為 4.6kb。利用TA克隆技術(shù)將前后半長分別克隆入pCR-XL-TOPO載體上，共獲得12株plwj-5’前半長克隆(命名為plwj-5’ half 1-12)和4株plwj-3’后半長克隆（命名為plwj-3’half 3-6）。通過對全長 plwj 基因組的酶切位點分析,在 vif 重疊區(qū)基因發(fā)現(xiàn)一個I單一酶切位點，并利用載體上的單一酶切位點I，將plwj-5’和plwj-3’前后半長分別雙酶切后進(jìn)行定向連接克隆，共獲得12株plwj全基因組克隆，利用載體多克隆位點兩端的I和I單一酶切位點對全基因組克隆進(jìn)行雙酶切鑒定,共切出兩段，分別為近似HIV全長基因組片段（約9.8kb）及質(zhì)粒載體片段（約3.5kb）。酶切片段大小均符合預(yù)期推斷，提示全基因組克隆構(gòu)建成功。

1 H2O; 2 lwj-5’half; 3 lwj-3’half; 4 DNA Marker DL15000

2.2 衍生病毒的產(chǎn)生及其感染活性的鑒定

將12株plwj全基因組克隆分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48~72小時后檢測轉(zhuǎn)染上清中p24抗原來確定其有無衍生病毒產(chǎn)生。轉(zhuǎn)染性實驗結(jié)果提示12株plwj全基因組克隆中有9株轉(zhuǎn)染上清p24抗原呈強(qiáng)陽性（OD>3.0），說明這些克隆株能在293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效地病毒復(fù)制，并產(chǎn)生衍生病毒。轉(zhuǎn)染上清經(jīng)0.45μm過濾后感染經(jīng)PHA-P刺激活化的PBMCs細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞病變產(chǎn)生情況并檢測感染上清中的p24抗原來鑒定其感染活性。感染性實驗結(jié)果顯示有2株全基因組克隆plwj10+6和plwj13+6的感染上清p24抗原呈強(qiáng)陽性（OD>3.0），有4株呈弱陽性（OD約0.8），其余的很低或呈陰性。此外，其中有兩株全基因組克?。╬lwj2+6和plwj5+6）各自轉(zhuǎn)染上清感染PBMCs細(xì)胞時感染性很低或呈弱陽性，但當(dāng)這兩株克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所產(chǎn)生的混合衍生病毒感染PBMCs細(xì)胞時則表現(xiàn)出強(qiáng)陽性，結(jié)果見表1。

表1 plwj全基因組克隆轉(zhuǎn)染和感染上清中P24抗原值

aThe numeral of plwj 1+4 represents that the full-length clone plwj was constructed by ligation with plwj-5’half clone1 and plwj-3’half clone4, and so on.bClones plwj5+6 and plwj2+6 produced infectious virus upon cotransfection.

2.3 感染性克隆plwj全基因組序列分析

利用HIV databases 庫中Sequence locator 工具對全基因組序列進(jìn)行定位，結(jié)果顯示plwj全長基因組共9719個堿基，包含了HIV-1所有的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控序列。基因重組分析顯示該毒株與consensus-B同源性最高，屬于HIV-1 B亞型，且沒有明顯的與其它任何亞型序列發(fā)生遺傳重組的跡象（圖3）。將該序列與國際上HIV-1 M組各亞型參考株的全長序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖4），進(jìn)一步證實plwj屬于HIV-1 B亞型的衍生株Thai-B亞型，而且與河南有償獻(xiàn)血人群中Thai-B亞型流行株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24最為接近，相對遠(yuǎn)離歐美B亞型毒株。序列耐藥分析發(fā)現(xiàn)plwj沒有導(dǎo)致現(xiàn)有抗病毒治療藥物（ARV）的耐藥突變，這與樣品采自中國開始大規(guī)模免費ARV治療之前的時間相一致。

圖3 plwj全長基因序列的重組分析

圖4 plwj全長基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

病毒包膜的V3環(huán)是病毒感染細(xì)胞的主要決定簇，由特征性四肽組成。通過對V3環(huán)關(guān)鍵氨基酸的分析可預(yù)測HIV-1輔助受體的可能使用情況。如果這些關(guān)鍵的預(yù)測位點中精氨酸（R）被谷氨酰胺(Q)替換，HIV-1毒株則由使用CXCR4變?yōu)槭褂肅CR5作為輔助受體進(jìn)入細(xì)胞。我們分析了plwj全基因組克隆及其母本株lwj和河南Thai-B亞型代表株pCNHN24 的V3環(huán)主要氨基酸序列，結(jié)果顯示三者V3環(huán)頂端四肽均為GPGR，而且其第11位均為帶正電荷的精氨酸（R），見表2。因此，可預(yù)測plwj株與其它兩株相似是利用CXCR4作為輔助受體。

表2 plwj全基因組克隆V3環(huán)主要氨基酸序列

*圖中紅色標(biāo)出V3 環(huán)第11位及頂端關(guān)鍵氨基酸序列

3 討論

長鏈擴(kuò)增是困擾全長基因組克隆的難點之一。1994 年Barnes 和Cheng 等分別建立了長鏈PCR技術(shù),使得幾十個kb 的基因組片段得到有效擴(kuò)增?？紤]到PCR擴(kuò)增的忠實性，我們采用Roche公司的Expand long template PCR system，該系統(tǒng)采用熱穩(wěn)定 Taq DNA 多聚酶和Tgo DNA 多聚酶混合物。該酶混合物不僅可以擴(kuò)增長片段，而且具有很高的保真性。此外，為減少PCR 過程導(dǎo)致的點突變，混合3次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行后續(xù)克隆。在克隆長片段時，我們曾嘗試用普通的克隆試劑盒，結(jié)果不理想，直到后來改用Topo XL PCR Cloning Kit。該系統(tǒng)是用DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）將PCR產(chǎn)物連接到載體上，整個反應(yīng)只需5min，而一般T4連接酶需過夜才能高效連接。此外，該克隆載體還引入ccdB （Control of cell death）基因，這樣可以降低克隆背景，節(jié)省篩選的時間。特殊的凝膠純化試劑（結(jié)晶紫純化）使得可以直接在可見光下進(jìn)行切膠純化，這樣可避免紫外線切割，從而提高長片段PCR克隆效率。

有文獻(xiàn)報告在構(gòu)建HIV 感染性分子克隆時最好選擇低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體[22],這是因為HIV 全長cDNA 兩端具有同向的長末端重復(fù)序列,在復(fù)制過程中容易發(fā)生同源重組,并導(dǎo)致內(nèi)含子的缺失,外源片段的插入,影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。此外,還應(yīng)盡量采用缺失重組基因[ recA (-) ]的宿主菌[23]。但值得注意的是,最早的感染性克隆pNL4-3 即是用高拷貝的pUC18 質(zhì)粒構(gòu)建而成,至今仍然被廣泛使用[24]。本文所用的質(zhì)粒構(gòu)建載體是采用pCR-XL-TOPO也是用高拷貝的pUC載體系列，而在一年多時間應(yīng)用過程中尚未發(fā)現(xiàn)上述不穩(wěn)定因素，當(dāng)然這還需要今后更長時間的實驗驗證其可行性。

HIV-1高度的遺傳多樣性，以及HIV-1復(fù)制過程中的高突變率、重組率和出錯率造成體內(nèi)大量HIV準(zhǔn)種的存在，這樣導(dǎo)致從前病毒基因組模板中擴(kuò)增獲得的序列必然呈現(xiàn)多樣性。本實驗構(gòu)建的12株全基因組克隆中僅有2株呈現(xiàn)強(qiáng)感染性，其余為無感染性或感染性不強(qiáng)。這可能是HIV在體內(nèi)復(fù)制過程中由于基因突變或缺失而導(dǎo)致其復(fù)制缺陷。值得關(guān)注的是，其中有兩株全基因組克?。╬lwj2+6和plwj5+6）各自轉(zhuǎn)染上清感染PBMCs細(xì)胞時感染性很低或呈弱陽性，但當(dāng)這兩株克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所產(chǎn)生的混合衍生病毒感染PBMCs細(xì)胞時則表現(xiàn)出強(qiáng)陽性，這預(yù)示著這兩株克隆由于基因變異使得在復(fù)制過程中產(chǎn)生缺陷病毒，但這兩株缺陷病毒在功能上卻能夠進(jìn)行互補(bǔ)，從而產(chǎn)生有感染性的衍生病毒。

plwj全基因組序列分析結(jié)果顯示plwj克隆株為Thai-B亞型，該毒株雖然來自福建但它可能與河南有償獻(xiàn)血人群中流行的Thai-B亞型毒株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24有共同的病毒起源，這與感染者自稱其是經(jīng)輸血感染HIV事實相吻合。序列耐藥分析發(fā)現(xiàn)plwj沒有導(dǎo)致現(xiàn)有抗病毒治療藥物（ARV）的耐藥突變，對ARV藥物依然敏感。這與樣品采自中國開始大規(guī)模免費ARV治療之前的時間相一致。

該株感染性克隆的成功構(gòu)建將為我省HIV-1病毒的生物學(xué)和免疫學(xué)特性研究提供有效的工具，為探討我國主要HIV-1 流行毒株（Thai-B 、CRF07_BC、CRF08_BC）的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時也為抗HIV-1疫苗和藥物的研究和評估及耐藥性檢測方面提供重要的工具。

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