修文瓊 劉光華 沈曉娜 王美愛 謝劍鋒 康育蘭 翁其珠 嚴(yán)延生

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中國福州呼吸道感染患兒中檢測到WU多瘤病毒

修文瓊1劉光華2沈曉娜1王美愛1謝劍鋒1康育蘭2翁其珠2嚴(yán)延生1

1.福建省疾病預(yù)防控制中心 2.福建省婦幼保健院

呼吸道感染是造成全球5歲以下兒童死亡的主要疾病，也是兒童住院治療的首要疾病。迄今，仍約有30%的小兒呼吸道感染原因不明[1]。人類呼吸道病毒種類繁多，小兒呼吸道感染可由不同病毒引起，以往的研究證明嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病毒病原是人類呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲、乙型) 、副流感病毒(主要是Ⅰ、Ⅲ型) 、腸道病毒和腺病毒。最近幾年，從人類呼吸道標(biāo)本中又鑒定出7種先前未知的病毒，分別是人偏肺病毒[2]，SARS冠狀病毒[3]，冠狀病毒NL63[4]，冠狀病毒HKU1[5]，人博卡病毒[6]，以及2007年剛被發(fā)現(xiàn)的KI多瘤病毒（KIPyV,)[7]和WU多瘤病毒(WUPyV,)[8]。WUPyV和KIPyV屬于多瘤病毒科的兩種人類呼吸道新病毒，含有雙鏈環(huán)狀基因組DNA結(jié)構(gòu)，是一類小DNA病毒。

為了了解這幾種呼吸道新病毒在本地區(qū)小兒中的感染情況，我們從2007年11月至2008年10月采集了在福建省福州市婦幼保健院因呼吸道感染住院的重癥監(jiān)護(hù)病房的57例小兒鼻咽抽取物標(biāo)本，并用分子生物學(xué)方法對幾種呼吸道病毒進(jìn)行檢測。另外，對一例有腹瀉癥狀的急性呼吸道感染門診患兒的痰、嘔吐物和排泄物標(biāo)本分別進(jìn)行了疑似病毒的檢測。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

采集57例因下呼吸道感染住院患兒（臨床診斷為支氣管炎或肺炎、毛細(xì)支氣管炎）的鼻咽抽取物（NPA，nasopharyngeal aspirates）標(biāo)本及一例門診患兒的痰、嘔吐物標(biāo)本和糞便標(biāo)本?；颊吣挲g從20天到4歲，平均年齡5.3月，中位年齡2.1月。82.5%為男孩，17.5%為女孩。

1.2 實驗方法

1.2.1標(biāo)本處理

在3mL DMEM采樣液中加入采集的NPA標(biāo)本，反復(fù)吹打在40C條件下送達(dá)的NPA標(biāo)本，加入雙抗（含200U/mL青霉素，200U/mL鏈霉素），分裝數(shù)管，置-700C保存。嘔吐物和糞便標(biāo)本同樣分裝數(shù)管，置-700C保存。如果糞便標(biāo)本較濃，可制備10%便懸液。具體方法是將糞便標(biāo)本加到1.5mL Ep管中，加入生理鹽水振蕩3次，每次10sec，然后靜置10 min，8 000 g離心5 min，吸上清進(jìn)行下一步實驗或置-700C保存。

1.2.2病毒DNA的提取

提取前將標(biāo)本凍融兩次后，10 000 g離心15min，吸取上清。采用德國Qiagen 公司的QIAamp Viral DNA Mini Kit，按其手冊所提供的方法提取病毒DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增鑒定

一對檢測引物[8]為AG0044（5‘TGTTACAAATAGCTGC AGGTCAA），AG0045（5‘GCTGCATAATGGGGAGTACC），擴(kuò)增產(chǎn)物為VP2蛋白的一段，長250bp；另一對確認(rèn)引物[8]為AG0048（5‘TGTTTTTCAAGTATGTTGCATCC），AG0049（5‘CACCCAAAAGACACTTAAAAGAAA），擴(kuò)增產(chǎn)物為大T抗原（LTAg）的一段，長244bp。引物由TaKaRa（大連）有限公司合成。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化及序列測定

采用德國Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，按其手冊所提供的方法純化PCR產(chǎn)物。對純化產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，克隆質(zhì)粒為pMD18T。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取將PCR產(chǎn)物片段克隆到質(zhì)粒的白色菌落，提取質(zhì)粒后測序。

1.2.5基因比對分析

將所測得的序列與GenBank中多株WUPyV的基因片段的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。多序列比對由ClustalX完成，進(jìn)化樹分析采用Phylip3.65軟件。同時也對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。所測得的4株WUPyV部分基因或全基因組的GenBank序列號是FJ890979（FZ13株）, FJ890980（FZTO株）, FJ890981（FZ18株）, FJ890982（FZTF株）。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測

從57例鼻咽抽取物（NPA）標(biāo)本中檢測到3例WUPyV感染陽性標(biāo)本，編號分別為FZ9、FZ13和FZ18，陽性率為5.3%。在另一門診病例的痰、嘔吐物標(biāo)本和糞便標(biāo)本中也檢測出WUPyV感染，編號分別為FZTO和FZTF。若加上這一門診病例，58例呼吸道感染患兒中，WUPyV感染的檢出率為6.9%。用檢測引物和確認(rèn)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的相對分子量分別是250bp和244bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定和比較分析

對5株WU多瘤病毒中的兩株FZ18株和FZTF株進(jìn)行全基因組序列測定，并對另兩株病毒FZ13株和FZTO株的大T抗原和小T抗原的部分編碼基因進(jìn)行序列測定，所測定的FZTO株與FZTF株的基因序列是一致的，分別對應(yīng)同一門診患兒的嘔吐物和糞便標(biāo)本。將FZ18株與FZTF株基因的250bp檢測片段與已上傳到GenBank的國內(nèi)外幾株WUPyV的基因片段（澳大利亞的B0、B3、B7、B9、B12株，美國的S1、S2、S3、S4株，韓國的KY-M-2338、KY-M-3293、KY-M-3302株，北京的BCH-004A、BCH-123A、BCH-312A、BCH-313A株，溫州的CLFF株和蘭州的LZ41株，對應(yīng)GenBank序列號分別是澳大利亞的EF444549、EF444558、EF444580、EF444592、EF444557，美國的EF444550-EF444553，韓國的EF655820、EU041606、EU041608，北京的EU597008、EU754876、EU754881、EU754882，溫州的EU296475和蘭州的EU304322）進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)出的氨基酸序列的比對分析。圖1顯示中國福建福州的FZ18株和FZTF株與其它已報道的18株WUPyV的親緣關(guān)系?？梢娤鄬Χ裕Ｖ軫Z18株與的北京BCH-004A株距離較近，F(xiàn)ZTF株則與蘭州的LZ41株、溫州的CLFF株、韓國的3株及參考株-澳大利亞的B0株和美國的S1-S4株關(guān)系較近。FZ18株和FZTF株基因的250bp檢測片段與B0株相比，F(xiàn)ZTF株未發(fā)生突變，F(xiàn)Z18株的核苷酸序列在1545bp處有一堿基突變，推導(dǎo)出的氨基酸序列亦不同,基因的此處突變?yōu)镸324I。FZ18株的此處突變與北京BCH-004A株相同。

圖1 福建2株人WU多瘤病毒（FZ18、FZTF）與Genbank中其它18株人WUPyV的VP2基因氨基酸序列的親緣關(guān)系樹

2.3 陽性病例的臨床癥狀

這5例患兒都為男童。FZ18號患兒才48天，2008年一月份發(fā)病，咳嗽兩天，加重，氣促半天；FZ13號患兒4個月，反復(fù)咳嗽10天以上，加劇，伴氣喘2天，臨床診斷為支氣管肺炎。FZ9號患兒2個月，咳嗽7天，加劇，伴氣喘、氣促1天；FZ13號和FZ9號病兒都在2007年12月份發(fā)病。另一患兒是門診病例，3歲半，也是2007年12月初發(fā)病，突然嘔吐，腹瀉，伴有咳嗽，醫(yī)生診斷為急性病毒性胃腸炎。分別收集他的痰、嘔吐物（FZTO）和排泄物（FZTF）進(jìn)行檢測和測序，所測得的序列是一致的。5個月后，這位患兒又咳嗽、嘔吐和腹瀉，但未在其痰、嘔吐物標(biāo)本和排泄物標(biāo)本中檢測到WUPyV感染?？傊?，這幾個患兒都在冬季發(fā)病，都有呼吸道感染癥狀，咳嗽等；有一門診患兒還有胃腸道感染癥狀。在57例住院患兒中WUPyV感染陽性病例年齡中位數(shù)是2個月，平均數(shù)是2.6個月。

2.4 其它病毒感染情況

對這些標(biāo)本也進(jìn)行了兩種常見呼吸道病毒-流感病毒（包括甲1、甲3和乙型）和呼吸道合胞病毒（RSV）及其它幾種呼吸道新病毒：如人博卡病毒（HBoV）、人偏肺病毒（HMPV）和KI多瘤病毒（KIPyV）的檢測。對糞便標(biāo)本進(jìn)行了人A組輪狀病毒（RVA）的檢測。檢測到2例甲3亞型流感病毒、1例乙型流感病毒感染和32例RSV感染及2例HBoV感染、1例KIPyV感染。也檢測到兩種病毒的混合感染，其中3例檢測出WUPyV的住院患兒都檢測出與RSV的混合感染；1例檢測出HBoV的患兒也檢測出與乙型流感病毒的混合感染；另一例檢測出甲3亞型流感病毒與RSV的混合感染。WUPyV與其它呼吸道病毒混合感染的檢出率是75.0%。

3 討論

多瘤病毒在全球大多數(shù)哺乳動物和鳥類中都存在，其中研究最多的感染動物的多瘤病毒是鼠多瘤病毒和猴空泡病毒（SV40）。1971年，兩種人類多瘤病毒BK和JC病毒分別從進(jìn)行同種異體移植的慢性腎盂腎炎病人的尿和進(jìn)展性多病灶腦白質(zhì)腦病的病人腦中分離出。BKPyV和JCPyV可引起持續(xù)性感染，在有免疫力的人中通常無癥狀，但在那些免疫抑制的病人中可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病[9]，這兩種病毒均與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，有報導(dǎo)在呼吸道分泌物中也發(fā)現(xiàn)BKPyV[10]。2008年,在人類皮膚癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種多瘤病毒科新病毒MCPyV ()[11]，最新報導(dǎo)在人呼吸道分泌物中也發(fā)現(xiàn)MCPyV[12]。在人類糞便標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)有BKPyV, JCPyV[13]和KIPyV[7]。最近報導(dǎo)在兒童急性胃腸炎的糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)WUPyV[14]，我們也在一位既有呼吸道感染癥狀又有急性胃腸炎癥狀的門診病人的痰、嘔吐物和糞便標(biāo)本中檢測到WUPyV感染，而從這位患兒的呼吸道標(biāo)本中未檢測到常見呼吸道病毒如RSV和流感病毒的感染，也未檢測出其它幾種呼吸道新病毒。這表明雖然WUPyV是呼吸道病毒病原，但也可在胃腸道的排泄物中存在，WUPyV似乎既可引起上、下呼吸道感染，也可引起腹瀉。以前的研究也表明了WUPyV感染既表現(xiàn)出呼吸道癥狀，也表現(xiàn)出胃腸道癥狀[7,15-17]。因此，推測WUPyV類似于人類其它多瘤病毒，既可通過呼吸道也可通過胃腸道傳播。我們在另3例檢測出WUPyV感染的住院患兒中都檢測出了RSV的感染，因此WUPyV在人類呼吸道感染中的臨床意義有待進(jìn)一步研究。

2007年報道在美國華盛頓地區(qū)鑒定WUPyV的陽性率為0.7%[8]，在密蘇里地區(qū)為2.7%[18]，在澳大利亞為3.0%[8]，在加拿大為2.5%[19]，在韓國WUPyV的陽性率高達(dá)7.0%[20]，并且有混合感染情況出現(xiàn)，與其它一些呼吸道病毒混合感染的檢出率是67.6%。中國最早報道了浙江一例WUPyV感染[21，22]，蘭州的感染率是2.2%[23]，北京的感染率是2.4%[24]。2008年報道WUPyV在法國的感染率是2.4%[25]，德國的感染率是4.9%[26]，英國的感染率是1.08%[27]，并且有混合感染情況，與RSV、HBoV和HMPV混合感染的檢出率是75%，類似于我們的檢測結(jié)果。由于我們都沒有檢測鼻病毒、腺病毒、冠狀病毒和腸道病毒等其它幾種呼吸道病毒，否則混合感染的檢出率更高。近來，美國報道在有呼吸道感染癥狀的兒童中WUPyV的陽性率為7.1%，無癥狀兒童中的陽性率為6.3%[28]；荷蘭報道在兒科重癥監(jiān)護(hù)病房，有或無呼吸道感染癥狀的兒童中WUPyV的陽性率為2.6%[29]。在我們的研究中，同一門診病人經(jīng)過5個月后（次年4月份），又出現(xiàn)呼吸道感染和腹瀉癥狀時，但我們沒有再次從他的痰液、嘔吐物或排泄物標(biāo)本中檢測到WUPyV，表明WUPyV沒有潛伏在其體內(nèi)形成持續(xù)性感染。顯然WUPyV的感染可發(fā)生在生命早期，也可能是使呼吸道疾病加重的一個因子。但WUPyV作為人類病原以及它的致病性有待進(jìn)一步研究和闡明。

[1] Heikkinen T, Jarvinen A. The common cold. Lancet, 2003, 361: 51-59.

[2] Van den Hoogen B G, de Jong J C, Groen J, et al. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nat Med, 2001, 7: 719-724.

[3] Ksiazek T G, Erdman D, Goldsmith C S, et al. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med, 2003, 348: 1953-1966.

[4] Van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink M F, et al. Identification of a new human coronavirus. Nat Med, 2004, 10: 368-373.

[5] Woo P C, Lau S K, Chu C M, et al. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia. J Virol, 2005, 79: 884-895.

[6] Allander T, Tammi M T, Eriksson M, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 12891-12896.

[7] Allander T, Andreasson K, Gupta S, et al. Identification of a third human polyomavirus. J Virol, 2007, 81: 4130-4136.

[8] Gaynor A M, Nissen M D, Whiley D M, et al. Identification of a novel polyomavirus from patients with acute respiratory tract infections. PLoS Pathol, 2007, 5(3): e64.

[9] Ahsan N, Shah KV. Polyomaviruses and human diseases. Adv Exp Med Biol. 2006, 577:1–18.

[10] Sundsfjord A, Spein AR, Lucht E, Flaegstad T, Seternes OM. Traavik T. Detection of BK virus DNA in nasopharyngeal aspirates from children with respiratory infections but not in saliva from immunodeficient and immunocompetent adult patients. J Clin Microbiol. 1994, 32:1390-4.

[11] Feng H, Shuda M, Chang Y, Moore PS. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 2008, 319:1096-100.

[12] Goh S, Lindau C, Tiveljung-Lindell A, Allander T. Merkel cell polyomavirus in respiratory tract secretions. Emerg Infect Dis. 2009, 15:489-91.

[13] Bofill-Mas S, Formiga-Cruz M, Clemente-Casares P, Calafell F, Girones R. Potential transmission of human polyoma-viruses through the gastrointestinal tract after exposure to virions or viral DNA. J Virol, 2001, 75:10290–9.

[14] Ren L, Gonzalez R, Xu X, Li J, Zhang J, Vernet G, et al. WU polyomavirus in fecal specimens of children with acute gastroenteritis, China. Emerg Infect Dis, 2009, 15:134-5.

[15] Lin F, Zheng M, Li H, Zheng C, Li X, Rao G, et al. WU polyomavirus in children with acute lower respiratory trac infections, China. J Clin Virol, 2008, 42:94-102.

[16] Han TH, Chung JY, Koo JW, Kim SW, Hwang ES. WU polyomavirus in children with acute lower respiratory tract infections, South Korea. Emerg Infect Dis, 2007, 13:1766–8.

[17] Le BM, Demertzis LM, Wu G, Tibbets RJ, Buller R, Arens MQ, et al. Clinical and epidemiologic characterization of WU polyomavirus infection, St. Louis, Missouri. Emerg Infect Dis, 2007, 13:1936–8.

[18] Le B H, Demertzis L M, Wu G, et al. Clinical and epidemiologic characterization of WU polyomavirus Infection, St. Louis, Missouri [J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(12): 1936-1938.

[19] Abed Y, Wang D, and Boivin Guy. WU polyomavirus in Children, Canada. Emerg Infect Dis, 2007, 13(12): 1939-1941.

[20] Han T H, Chung J Y, Koo J W, et al. WU polyomavirus in children with acute lower respiratory tract infections, South Korea. Emerg Infect Dis, 2007, 13(11): 1766-1768.

[21] 林鋒，鄭美云，李樺，等.WU多瘤病毒在中國浙江地區(qū)的發(fā)現(xiàn)與鑒定[J].病毒學(xué)報，2008，24（1）：69-71.

[22] Lin F, Zheng M, Li H, et al. WU polyomavirus in children with acute lower respiratory tract infections, China. J Clin Virol, 2008, 42: 94-102.

[23] 原新慧，徐子乾，謝志萍，等.我國急性呼吸道感染患兒中檢測到KI和WU多瘤病毒[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2008，22（1）：21-23.

[24] Ren L, Gonzalez R, Xie Z, et al. WU and KI polyomavirus present in the respiratory tract of children, but not in immunocompetent adults. J Clin Virol, 2008, 43: 330-333.

[25] Foulongne V, Brieu N, Jeziorski E, et al. KI and WU polyomaviruses in children, France. Emerg Infect Dis, 2008, 14(3): 523-525.

[26] Neske F, Blessing K, Ullrich F, et al. WU polyomavirus infection in children, Germany. Emerg Infect Dis, 2008, 14(4): 680-681.

[27] Kiasari B A, Vallely P J, Corless C E, et al. Age-related pattern of KI and WU polyomavirus infection. J Clin Virol, 2008, 43: 123-125.

[28] Wattier R L, Vazquez M, Weibel C, et al. Role of human polyomaviruses in respiratory tract disease in young children. Emerg Infect Dis, 2008, 14(11): 1766-1768.

[29] Pol A C, Wolfs T F W, Jansen N J G, et al. Human Bocavirus and KI/WU polyomaviruses in pediatric intensive care patients. Emerg Infect Dis, 2009, 15(3): 454-457.