鐘鳳林 郭志雄 潘東明

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琯溪蜜柚汁胞ACTIN的分離鑒定和cDNA克隆

鐘鳳林1,2郭志雄1潘東明2

1.福建農(nóng)林大學園藝學院 2.福建農(nóng)林大學園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所

對琯溪蜜柚粒化與正常汁胞雙向電泳分析，獲得一個在粒化中上調表達的差異蛋白質點，經(jīng)過質譜鑒定、生物信息學分析，為肌動蛋白(Actin)，以琯溪蜜柚粒化汁胞cDNA為模板，根據(jù)Actin氨基酸序列設計引物，進行全長的擴增，得到Actin開放閱讀框包含1134堿基，編碼377氨基酸。其核酸序列與黑楊派(Populus trichocarpa)、棉花(Gossypium hirsutum）、蓖麻(Ricinus communis）、圓葉錦葵(Malva pusilla) ACT的同源性在89%以上。

琯溪蜜柚 ACTIN 雙向電泳 串聯(lián)質譜 克隆

肌動蛋白(Actin)是真核生物細胞中普遍存在的一種重要的蛋白質，構成細胞骨架中的微絲(Microfilament)系統(tǒng)，參與真核生物細胞的許多重要的生命活動[1]。肌動蛋白是單一多肽鏈的球狀蛋白質(G-actin)，由375~377個氨基酸殘基所組成，分子量為42kD。生物體中包含7個肌動蛋白基因，編碼不同的肌動蛋白同工蛋白質。高等植物肌動蛋白在進化過程中保持高度的保守性和同源性，且具有組織和器官特異性的表達。研究肌動蛋白在擬南芥表皮毛中排列與分布時發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白對細胞形態(tài)與生長極性尤為重要，在表皮毛發(fā)育過程中破壞肌動蛋白會引起表皮毛彎曲和分支[2]。Baluska等在研究擬南芥和Rye幼苗時發(fā)現(xiàn)，沒有F-actin條件下細胞一樣可以分裂，但植物會變矮，說明F-actin是細胞伸長所必需[3]。范小平等通過RNAi序列構建載體轉化棉花，表明RNAi載體轉基因植株棉纖維發(fā)育遲緩或受到抑制，但GhACT1只是屬于影響纖維生長的多基因中的一個，而不是唯一決定棉纖維長度的基因[4]。

琯溪蜜柚 ((L.) Osbeck) 原產(chǎn)福建省平和縣琯溪河畔，是我國蜜柚優(yōu)良品種之一，有400多年的栽培歷史。柑橘果實?；浅墒炱诤筒珊筚A藏期的生理病害。其主要表現(xiàn)為汁胞異常膨大，變硬，汁胞木質化，風味變淡，一般情況下為囊瓣近蒂端汁胞先發(fā)生?；鬂u向果心發(fā)展，果心處長形汁胞最為嚴重[5-7]。通過差異蛋白質組學研究?；c正常汁胞，對獲得的差異蛋白質點進行分離、鑒定和cDNA克隆，為從轉錄水平了解粒化的分子機理奠定了基礎。

1 方法

1.1 材料

2007年9月18日，琯溪蜜柚采至福建省平和縣小溪村大坑果園，選擇大小均勻，色澤一致、無病蟲、無損傷的果實。當日從平和寄回實驗室，掰開果實，液氮處理、保存、備用。

1.2 雙向凝膠電泳

取琯溪蜜柚汁胞，總蛋白的提取、蛋白質含量測定及雙向電泳等參照賴呈純等(2009) 的方法[8]。

1.3 差異表達蛋白點質譜鑒定

差異蛋白點進行脫色、膠內胰酶酶切(in-gel digestion)和肽段提取，然后進行肽質量指紋譜(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)分析。檢索數(shù)據(jù)庫為NCBInr；檢索種屬為：all，數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶。質量誤差范圍設置：PMF 0.3 Da，MS/MS 0.4 Da；在數(shù)據(jù)庫檢索時胰酶自降解峰和污染物質的峰都手工剔除[9,10]。

1.4 琯溪蜜柚汁胞RNA提取及總RNA含量和濃度測定

取琯溪蜜柚汁胞樣品，參照鐘鳳林等方法提取RNA[11]。

1.5 琯溪蜜柚汁胞中ACTIN cDNA ORF的克隆

1.5.1 cDNA合成及引物設計

按Invitrogen RT-PCR、3'和5'-RACE說明書中附加方案說明進行逆轉錄，合成cDNA。

根據(jù)ACTIN [Gossypium hirsutum] (gi|32186906)在蛋白的起始位置和結尾設計特異引物進行cDNA全長擴增。引物由上海博尚生物技術有限公司合成。

ACTR(Nco I): 5'- GCATA CCATGG TTAGAAGCAC TTCCTGTGGA CAATGGA

ACTF(Nde I): 5'- GCATA GTATAC ATG GCC GAT GCT GAG GAT ATT C

1.5.2 PCR擴增

反應程序為：94℃ 5.0min，94℃ 45s，63℃ 45s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.5.3序列測定、序列分析

膠回收PCR產(chǎn)物，連接、轉化、涂板、篩選和PCR鑒定。菌液送上海英駿公司進行測序。序列通過Expasy、NCBI網(wǎng)址和DNAMAN軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 差異蛋白質點APX的獲得

正常汁胞和?；偟鞍椎碾p向電泳差異比較后，把其中的50個差異蛋白質點經(jīng)過膠內酶解、MAIDI-TOF-TOF MS以及MASCOT搜索，得到差異蛋白質點為Actin (圖1為琯溪蜜柚?；^程中的差異蛋白質Actin的局部放大示意圖)。獲得高品質肽質量指紋(PMF)(圖2 A)，然后根據(jù)PMF自動選取5個的峰形最好、強度最高的肽離子送入CID碰撞，得到的碎片離子再用TOF質譜分析獲得肽碎片指紋(FFP: fragment fingerprint 圖2 B)。使用MASCOT的離子搜索模式搜索蛋白質NCBInr綠色植物蛋白質數(shù)據(jù)庫得到匹配的蛋白(圖2 C、D)。Actin其與棉花()actin Score為393。

注：A為正常汁胞；B為粒化汁胞；↑表示表達量上升

注：A為PMF；B為FFP；C為檢索值；D為匹配的結果

2.2 Actin cDNA ORF的克隆與分析

2.2.1 RNA的提取及質量分析

用Trizol法提取琯溪蜜柚粒化汁胞總RNA，電泳檢測顯示(圖3，M為DL2000 Marker)，分離得到的總RNA的質量較好，條帶完整，紫外檢測和分析，提取分離得到的總RNA其A260/ A280值為1.90，說明該樣品純度高，適合PCR擴增。

圖3琯溪蜜柚汁胞RNA電泳結果

2.2.2 ACTIN ORF 擴增結果

將開放閱讀框的兩端加上酶切位點和保護堿基后設計引物，以帶Oligo-dT的接頭引物的cDNA為模板，進行PCR擴增ORF，電泳結果獲得了大小約為1100bp的特異產(chǎn)物(圖4，M為DL2000 Marker)。膠回收純化該片段，連接、轉化、涂板、篩選和PCR鑒定，送菌液測序。菌液提取質粒后進行測序。

圖4 琯溪蜜柚汁胞的ORF電泳圖

下劃線、方框表示引物區(qū)

測序后得到的cDNA序列長為1156，開放閱讀框(ORF)共有1134個堿基組成，編碼377個氨基酸，ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。通過expasy分析，氨基酸位點55~65具有Actins signature1信號，氨基酸位點106~118具有Actins and actin-related proteins signature信號，氨基酸位點358-366具有ACTINS signature2信號(圖5)。

序列分析表明，琯溪蜜柚ACTIN cDNA的核苷酸序列以及推導的氨基酸序列與許多植物來源的ACT有很高的同源性。其核酸序列與黑楊派()的ACT1、ACT9、棉花(）ACT1、ACT11同源性高達90%，與蓖麻(）ACT、圓葉錦葵() ACT、棉花(）ACT4、ACT8、ACT9的同源性89%。

2.2.3 Actin ORF推導的氨基酸與其它植物Actin氨基酸序列比對

由DNAMAN軟件分析可知，Actin cDNA編碼377個氨基酸，理論分子量為41.7014KD，理論等電點(pI)為5.45，屬酸性或陰離子型。經(jīng)由DNAMAN軟件分析比對后得到與黑楊派(Populus trichocarpa)的ACT1、ACT9、棉花(Gossypium hirsutum）ACT1、ACT11等的氨基酸序列比對圖(圖6)，可知：ACT 與推導的氨基酸的同源性都達到了99％以上。

圖6 Actin cDNA編碼氨基酸序列與其它植物ACTIN的多重序列比對

3 討論

在高等植物中，肌動蛋白在進化過程中保持高度的保守性和同源性，以基因家族形式存在，可分為營養(yǎng)體基因與生殖細胞基因，并且肌動蛋白的表達有組織、器官特異性和發(fā)育階段特異性[12-14]。肌動蛋白骨架對植物高度特異化的細胞的形態(tài)發(fā)生和功能起著重要作用，同時在高等植物形態(tài)發(fā)生的細胞分裂和伸長過程中起著關鍵的調節(jié)作用[15，16]。Li等從cDNA文庫中篩選出15個actin基因中，real-time PCR結果表明有5個肌動蛋白基因在纖維中特異表達，推斷在GhACT1缺失時，其他4個基因仍正常行使功能，彌補和維持纖維生長，使纖維繼續(xù)伸長，尤其在伸長期后期GhACT1的缺失對纖維伸長的影響甚微[17]。

本研究通過分離、鑒定和克隆，獲得了Actin的cDNA全長，并表明在琯溪蜜柚汁胞發(fā)育階段的?；蠥ctin表達的變化，可能是Actin與肌球蛋白的相互作用，參與了細胞運動有關活動，使得琯溪蜜柚汁胞生長與延伸發(fā)生改變，猜測其對構建細胞骨架和適應多樣脅迫環(huán)境變化有著重要作用。有關這方面的有待進一步進行。

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