李房英 黃彥晶 吳少華

三角梅ISSR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

李房英1黃彥晶2吳少華2

1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院 2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院

對影響三角梅ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的各個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立適合三角梅的ISSR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體積為20μL，其中10×buffer(含Mg2＋)2.0μL，dNTP 250 μmol/L，Taq酶1.0U，引物0.3μmol/L，模板DNA20ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，51.6℃退火1min，72℃延伸2min，34個循環(huán)；最后72℃延伸7min。該反應(yīng)體系標(biāo)記點(diǎn)位清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好，適宜三角梅ISSR分析，為應(yīng)用ISSR技術(shù)鑒定三角梅種質(zhì)資源、分子標(biāo)記輔助選擇育種及其遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

三角梅 ISSR 體系建立 優(yōu)化

三角梅(Willd)又名九重葛、毛寶巾、勒杜鵑，在我國已有100多年的栽培歷史，品種豐富。我國部分研究者在同工酶水平上對三角梅品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析但存在難以解釋之處[1]，至今仍有分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、分類手段有一定的局限性，所得分類結(jié)果不一致以及同名異物、同物異名等問題，從而給生產(chǎn)、園林應(yīng)用、交流等方面帶來諸多困難。而三角梅有關(guān)分子標(biāo)記方面的研究仍是空白，因此利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行三角梅的分類、品種鑒定等研究顯得尤為重要。

ISSR（簡單重復(fù)序列間隔區(qū)，Inter-Simple Sequence Repeat）是由Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記[2]。ISSR具有操作簡單，標(biāo)記重復(fù)性好，穩(wěn)定程度高，多態(tài)性豐富，DNA用量少，成本低等優(yōu)點(diǎn)。ISSR標(biāo)記已廣泛地用于遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、基因定位、分子標(biāo)記育種等方面[3]。

試驗(yàn)對影響三角梅ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的各個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立適合三角梅的ISSR-PCR反應(yīng)體系，為應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行三角梅種質(zhì)資源研究、分子育種等創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為三角梅“亮葉紫花”品種嫩葉。取材自廈門植物園。

1.2 試劑和儀器

ISSR引物序列源自加拿大的University of British Columbia，購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Taq酶等試劑購自大連寶生物（TAKARA）有限公司。梯度PCR儀Tgradient為Biometra公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1三角梅基因組DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法[4]提取基因組DNA。DNA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，用TU－1810紫外分光光度計(jì)測定OD260/ OD280的吸光值，確定DNA 濃度和質(zhì)量。DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系參數(shù)的優(yōu)化

參照其它物種ISSR反應(yīng)的條件[5~7]以及預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，初步設(shè)定各成分的用量：ISSR-PCR反應(yīng)體積為20μL，10×buffer(含Mg2＋)2.0μL，模板DNA20ng，Taq酶1.0U，引物0.3μmol/L，dNTP200μmol/L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序是：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，38個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析上，100V穩(wěn)壓電泳2.0h，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

經(jīng)過初步的引物篩選，選用引物UBC814(CTC TCT CTC TCT CTC TA)進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化。對影響ISSR-PCR擴(kuò)增的主要參數(shù)設(shè)置了不同的梯度：采用梯度PCR模式，以TM值52.18為中心，生成了48.1℃、49.2℃、50.4℃、51.6℃、52.8℃、54℃、55.2℃ 7個退火溫度梯度；設(shè)計(jì)10、20、30、50、75、100、150ng 7個模板DNA用量梯度；0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5U 7個Taq酶用量梯度；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μmol/L 7個引物濃度梯度；100、150、200、250、300、350、400μmol/L 7個dNTP濃度梯度以及31、34、37、40、43、46、49 7個循環(huán)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測

用1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性，由圖1的結(jié)果可以看到1條整齊的條帶，無彌散的熒光出現(xiàn)，加樣孔清晰，表明所提取的DNA樣品較純，基本沒有多糖等雜質(zhì)，無降解和RNA污染。DNA樣品在紫外分光光度計(jì)測定OD260、OD280，OD260/OD280比值在1.65~1.85之間，符合PCR的要求。

M：15000bp DNA ladder；1～5為三角梅樣品

2.2 退火溫度對擴(kuò)增結(jié)果的影響

退火溫度不僅與引物序列有關(guān)，還與物種DNA的序列有密切關(guān)系，因此在進(jìn)行ISSR擴(kuò)增優(yōu)化之前確定引物的退火溫度非常重要[8]。退火溫度不同，產(chǎn)生錯配的程度也不同，通常較低的溫度在保證引物與模板結(jié)合穩(wěn)定性的同時，也會使引物與模板之間未完全配對的一些位點(diǎn)間得到擴(kuò)增，即產(chǎn)生一定的錯誤擴(kuò)增。因此，在允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可減少引物和模板之間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性[9]。從ISSR隨機(jī)引物UBC801～UBC900中挑取若干個引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的預(yù)備，從中選擇UBC814 作為體系優(yōu)化的引物。由圖2中可見，溫度低于50.4℃時，條帶減少并模糊；溫度高于52.8℃時，片段減少，51.6℃時，譜帶最清晰，多態(tài)性最好，由此確定引物UBC814的最佳退火溫度為51.6℃。

M：2000bp DNA ladder；1～7為退火溫度

2.3 模板DNA用量對擴(kuò)增結(jié)果的影響

PCR反應(yīng)中對模板DNA濃度要求的范圍通常較寬，但研究表明，模板DNA濃度過低，分子碰撞的概率低，偶然性大，擴(kuò)增產(chǎn)物無或不穩(wěn)定；模板量過高，會相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增[10]。圖3是模板DNA不同用量的擴(kuò)增結(jié)果。在20μL反應(yīng)體系中，添加10～30ng 模板DNA的效果最佳，DNA濃度高于50ng時，擴(kuò)增出的條帶減少，在20～30ng時條帶最清晰。從節(jié)約模板和擴(kuò)增效果出發(fā)，20ng的模板DNA濃度用于三角梅ISSR-PCR擴(kuò)增為最佳選擇。

M：2000bp DNA ladder；1～7模板DNA用量

2.4 Taq酶用量對擴(kuò)增結(jié)果的影響

Taq酶使用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的成功與否，使用高濃度的Taq酶不僅提高了成本，而且也容易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增產(chǎn)物；而Taq酶濃度過低時，則會導(dǎo)致產(chǎn)物的合成效率下降。Taq酶單位的變化也對條帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響較大。由圖4可見，隨著所加Taq酶單位的逐漸增多，條帶的數(shù)量開始急劇減少，亮度也開始逐漸減弱。當(dāng)Taq酶在1.0U～2.0U時條帶較清晰穩(wěn)定，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇1U的Taq酶用量。

M：2000bp DNA ladder；1～7Taq酶濃度分別是

2.5 隨機(jī)引物濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響

引物濃度的變化實(shí)質(zhì)上是改變了引物和模板配對的幾率，從而影響擴(kuò)增結(jié)果。引物濃度過低，導(dǎo)致引物和模板的結(jié)合率降低，使擴(kuò)增反應(yīng)過早終止，擴(kuò)增條帶很弱，甚至得不到可觀察的結(jié)果；引物濃度過高，引物與模板的非特異性配對增多，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增[11]。由圖5看出，20μL反應(yīng)體系中，引物濃度低于0.2μmol/L 時，分子量相對較小的條帶較弱，引物濃度高于0.4μmol/L 時，分子量相對較大的條帶較弱，當(dāng)濃度為0.3μmol/L時，條帶較清晰穩(wěn)定。因此選擇0.3μmol/L為反應(yīng)體系的最佳引物濃度。

M：2000bp DNA ladder；1～7引物濃度

2.6 dNTP濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響

dNTP作為擴(kuò)增的底物，直接影響PCR擴(kuò)增。底物濃度過高，會導(dǎo)致PCR錯配，從而使擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，此外過量的引物濃度還會導(dǎo)致引物二聚體的形成；底物濃度過低會影響合成效率，甚至?xí)蜻^早的消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果[12]。由圖6可知，dNTP的濃度低于200μmol/L，擴(kuò)增產(chǎn)物明顯減少或擴(kuò)增出來的條帶模糊不清，當(dāng)dNTP的濃度高于300μmol/L時，擴(kuò)增產(chǎn)物減少。根據(jù)條帶出現(xiàn)情況，選擇250μmol/L為反應(yīng)體系中dNTP的濃度。

M：2000bp DNA ladder；1～7dNTP濃度分別

2.7 循環(huán)數(shù)對擴(kuò)增結(jié)果的影響

PCR的循環(huán)次數(shù)決定產(chǎn)量，次數(shù)太少，產(chǎn)物量極低，次數(shù)太多，達(dá)到反應(yīng)平臺后，循環(huán)不會使產(chǎn)物明顯增加，反而引起非特異性擴(kuò)增。不同物種適宜的循環(huán)次數(shù)不同[13]，如小蒼蘭[3]為35次，臘梅[10]為38次。循環(huán)數(shù)對三角梅ISSR-PCR擴(kuò)增的影響見圖7。試驗(yàn)結(jié)果表明循環(huán)數(shù)低于34次時，擴(kuò)增譜帶較弱，多態(tài)性降低；循環(huán)數(shù)過高會使一些譜帶亮度過強(qiáng)，掩蓋了弱帶。34個循環(huán)擴(kuò)增的譜帶清晰，多態(tài)性好。

M：2000bp DNA ladder；1～7循環(huán)數(shù)

2.8 優(yōu)化反應(yīng)體系的確定

通過試驗(yàn)，對三角梅ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，適合三角梅ISSR分析的反應(yīng)體系是：20μL體積中，模板DNA20ng，引物0.3μmol/L，dNTP 250μmol/L，Taq酶1.0U，10×buffer(含Mg2＋)2.0μL；PCR擴(kuò)增程序是94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，51.6℃退火1min，72℃延伸2min，34個循環(huán)；最后72℃延伸7min。利用此優(yōu)化體系，在51.6℃的退火溫度下，對三角梅六個樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。由圖8可知，ISSR-PCR擴(kuò)增得到較為清晰穩(wěn)定的ISSR譜帶，并具有較多條帶。

M：2000bp DNA ladder；1～6為三角梅6個品種

3 討論

由于ISSR引物序列較長，退火溫度較高，具有RAPD的操作簡單和SSR的多態(tài)性好的優(yōu)點(diǎn)，然而它的重復(fù)性比RAPD高，在引物設(shè)計(jì)上比SSR技術(shù)簡單得多，無需預(yù)先知道DNA序列即可用引物對其進(jìn)行擴(kuò)增[14]。ISSR分子標(biāo)記具有操作簡單，標(biāo)記重復(fù)性好，穩(wěn)定程度高，多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常理想的檢測三角梅種內(nèi)遺傳變異的分子標(biāo)記。

ISSR分子標(biāo)記是基于PCR的標(biāo)記，其反應(yīng)結(jié)果受到諸如退火溫度、循環(huán)次數(shù)、模板DNA質(zhì)量及濃度、Taq酶用量、引物濃度、dNTP濃度等多種因素的影響。因此，為了獲得重復(fù)性和可靠性較高的ISSR譜帶，在研究時都應(yīng)建立起合適的反應(yīng)體系并對其進(jìn)行優(yōu)化，特別是第一次在某種生物上應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)的時候。同時還應(yīng)注意盡可能的使用統(tǒng)一廠家的藥劑和同一儀器設(shè)備才能保證分析結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，逐一研究各因素不同處理水平對ISSR-PCR的影響，比較系統(tǒng)和精細(xì)地研究了各主要因子的影響，建立了三角梅ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系。同時，本研究為三角梅種質(zhì)資源分析、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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