李房英 黃彥晶 吳少華

三角梅ISSR反應體系的建立和優(yōu)化

李房英1黃彥晶2吳少華2

1.福建農林大學園林學院 2.福建農林大學園藝學院

對影響三角梅ISSR-PCR擴增反應的各個參數(shù)進行優(yōu)化，建立適合三角梅的ISSR反應體系：PCR反應體積為20μL，其中10×buffer(含Mg2＋)2.0μL，dNTP 250 μmol/L，Taq酶1.0U，引物0.3μmol/L，模板DNA20ng。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，51.6℃退火1min，72℃延伸2min，34個循環(huán)；最后72℃延伸7min。該反應體系標記點位清晰、穩(wěn)定、重復性好，適宜三角梅ISSR分析，為應用ISSR技術鑒定三角梅種質資源、分子標記輔助選擇育種及其遺傳多樣性研究奠定了基礎。

三角梅 ISSR 體系建立 優(yōu)化

三角梅(Willd)又名九重葛、毛寶巾、勒杜鵑，在我國已有100多年的栽培歷史，品種豐富。我國部分研究者在同工酶水平上對三角梅品種進行親緣關系分析但存在難以解釋之處[1]，至今仍有分類標準不統(tǒng)一、分類手段有一定的局限性，所得分類結果不一致以及同名異物、同物異名等問題，從而給生產(chǎn)、園林應用、交流等方面帶來諸多困難。而三角梅有關分子標記方面的研究仍是空白，因此利用分子標記技術進行三角梅的分類、品種鑒定等研究顯得尤為重要。

ISSR（簡單重復序列間隔區(qū)，Inter-Simple Sequence Repeat）是由Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性的分子標記[2]。ISSR具有操作簡單，標記重復性好，穩(wěn)定程度高，多態(tài)性豐富，DNA用量少，成本低等優(yōu)點。ISSR標記已廣泛地用于遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、基因定位、分子標記育種等方面[3]。

試驗對影響三角梅ISSR-PCR擴增反應的各個參數(shù)進行優(yōu)化，建立適合三角梅的ISSR-PCR反應體系，為應用ISSR分子標記技術進行三角梅種質資源研究、分子育種等創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為三角梅“亮葉紫花”品種嫩葉。取材自廈門植物園。

1.2 試劑和儀器

ISSR引物序列源自加拿大的University of British Columbia，購自上海生物工程技術服務有限公司。Taq酶等試劑購自大連寶生物（TAKARA）有限公司。梯度PCR儀Tgradient為Biometra公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1三角梅基因組DNA的提取

采用改進的CTAB法[4]提取基因組DNA。DNA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，用TU－1810紫外分光光度計測定OD260/ OD280的吸光值，確定DNA 濃度和質量。DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ISSR-PCR反應體系參數(shù)的優(yōu)化

參照其它物種ISSR反應的條件[5~7]以及預備試驗的結果，初步設定各成分的用量：ISSR-PCR反應體積為20μL，10×buffer(含Mg2＋)2.0μL，模板DNA20ng，Taq酶1.0U，引物0.3μmol/L，dNTP200μmol/L。PCR擴增反應程序是：94℃預變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，38個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析上，100V穩(wěn)壓電泳2.0h，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

經(jīng)過初步的引物篩選，選用引物UBC814(CTC TCT CTC TCT CTC TA)進行PCR反應體系的建立和優(yōu)化。對影響ISSR-PCR擴增的主要參數(shù)設置了不同的梯度：采用梯度PCR模式，以TM值52.18為中心，生成了48.1℃、49.2℃、50.4℃、51.6℃、52.8℃、54℃、55.2℃ 7個退火溫度梯度；設計10、20、30、50、75、100、150ng 7個模板DNA用量梯度；0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5U 7個Taq酶用量梯度；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μmol/L 7個引物濃度梯度；100、150、200、250、300、350、400μmol/L 7個dNTP濃度梯度以及31、34、37、40、43、46、49 7個循環(huán)數(shù)。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測

用1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性，由圖1的結果可以看到1條整齊的條帶，無彌散的熒光出現(xiàn)，加樣孔清晰，表明所提取的DNA樣品較純，基本沒有多糖等雜質，無降解和RNA污染。DNA樣品在紫外分光光度計測定OD260、OD280，OD260/OD280比值在1.65~1.85之間，符合PCR的要求。

M：15000bp DNA ladder；1～5為三角梅樣品

2.2 退火溫度對擴增結果的影響

退火溫度不僅與引物序列有關，還與物種DNA的序列有密切關系，因此在進行ISSR擴增優(yōu)化之前確定引物的退火溫度非常重要[8]。退火溫度不同，產(chǎn)生錯配的程度也不同，通常較低的溫度在保證引物與模板結合穩(wěn)定性的同時，也會使引物與模板之間未完全配對的一些位點間得到擴增，即產(chǎn)生一定的錯誤擴增。因此，在允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可減少引物和模板之間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性[9]。從ISSR隨機引物UBC801～UBC900中挑取若干個引物進行PCR擴增的預備，從中選擇UBC814 作為體系優(yōu)化的引物。由圖2中可見，溫度低于50.4℃時，條帶減少并模糊；溫度高于52.8℃時，片段減少，51.6℃時，譜帶最清晰，多態(tài)性最好，由此確定引物UBC814的最佳退火溫度為51.6℃。

M：2000bp DNA ladder；1～7為退火溫度

2.3 模板DNA用量對擴增結果的影響

PCR反應中對模板DNA濃度要求的范圍通常較寬，但研究表明，模板DNA濃度過低，分子碰撞的概率低，偶然性大，擴增產(chǎn)物無或不穩(wěn)定；模板量過高，會相應增加非特異性產(chǎn)物的擴增[10]。圖3是模板DNA不同用量的擴增結果。在20μL反應體系中，添加10～30ng 模板DNA的效果最佳，DNA濃度高于50ng時，擴增出的條帶減少，在20～30ng時條帶最清晰。從節(jié)約模板和擴增效果出發(fā)，20ng的模板DNA濃度用于三角梅ISSR-PCR擴增為最佳選擇。

M：2000bp DNA ladder；1～7模板DNA用量

2.4 Taq酶用量對擴增結果的影響

Taq酶使用量直接影響擴增反應的成功與否，使用高濃度的Taq酶不僅提高了成本，而且也容易產(chǎn)生非特異擴增產(chǎn)物；而Taq酶濃度過低時，則會導致產(chǎn)物的合成效率下降。Taq酶單位的變化也對條帶的數(shù)量和強弱影響較大。由圖4可見，隨著所加Taq酶單位的逐漸增多，條帶的數(shù)量開始急劇減少，亮度也開始逐漸減弱。當Taq酶在1.0U～2.0U時條帶較清晰穩(wěn)定，從經(jīng)濟角度考慮，選擇1U的Taq酶用量。

M：2000bp DNA ladder；1～7Taq酶濃度分別是

2.5 隨機引物濃度對擴增結果的影響

引物濃度的變化實質上是改變了引物和模板配對的幾率，從而影響擴增結果。引物濃度過低，導致引物和模板的結合率降低，使擴增反應過早終止，擴增條帶很弱，甚至得不到可觀察的結果；引物濃度過高，引物與模板的非特異性配對增多，出現(xiàn)非特異性擴增[11]。由圖5看出，20μL反應體系中，引物濃度低于0.2μmol/L 時，分子量相對較小的條帶較弱，引物濃度高于0.4μmol/L 時，分子量相對較大的條帶較弱，當濃度為0.3μmol/L時，條帶較清晰穩(wěn)定。因此選擇0.3μmol/L為反應體系的最佳引物濃度。

M：2000bp DNA ladder；1～7引物濃度

2.6 dNTP濃度對擴增結果的影響

dNTP作為擴增的底物，直接影響PCR擴增。底物濃度過高，會導致PCR錯配，從而使擴增出現(xiàn)非特異性擴增，此外過量的引物濃度還會導致引物二聚體的形成；底物濃度過低會影響合成效率，甚至會因過早的消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增效果[12]。由圖6可知，dNTP的濃度低于200μmol/L，擴增產(chǎn)物明顯減少或擴增出來的條帶模糊不清，當dNTP的濃度高于300μmol/L時，擴增產(chǎn)物減少。根據(jù)條帶出現(xiàn)情況，選擇250μmol/L為反應體系中dNTP的濃度。

M：2000bp DNA ladder；1～7dNTP濃度分別

2.7 循環(huán)數(shù)對擴增結果的影響

PCR的循環(huán)次數(shù)決定產(chǎn)量，次數(shù)太少，產(chǎn)物量極低，次數(shù)太多，達到反應平臺后，循環(huán)不會使產(chǎn)物明顯增加，反而引起非特異性擴增。不同物種適宜的循環(huán)次數(shù)不同[13]，如小蒼蘭[3]為35次，臘梅[10]為38次。循環(huán)數(shù)對三角梅ISSR-PCR擴增的影響見圖7。試驗結果表明循環(huán)數(shù)低于34次時，擴增譜帶較弱，多態(tài)性降低；循環(huán)數(shù)過高會使一些譜帶亮度過強，掩蓋了弱帶。34個循環(huán)擴增的譜帶清晰，多態(tài)性好。

M：2000bp DNA ladder；1～7循環(huán)數(shù)

2.8 優(yōu)化反應體系的確定

通過試驗，對三角梅ISSR-PCR反應體系進行了優(yōu)化，適合三角梅ISSR分析的反應體系是：20μL體積中，模板DNA20ng，引物0.3μmol/L，dNTP 250μmol/L，Taq酶1.0U，10×buffer(含Mg2＋)2.0μL；PCR擴增程序是94℃預變性5min；94℃變性1min，51.6℃退火1min，72℃延伸2min，34個循環(huán)；最后72℃延伸7min。利用此優(yōu)化體系，在51.6℃的退火溫度下，對三角梅六個樣品進行ISSR-PCR擴增。由圖8可知，ISSR-PCR擴增得到較為清晰穩(wěn)定的ISSR譜帶，并具有較多條帶。

M：2000bp DNA ladder；1～6為三角梅6個品種

3 討論

由于ISSR引物序列較長，退火溫度較高，具有RAPD的操作簡單和SSR的多態(tài)性好的優(yōu)點，然而它的重復性比RAPD高，在引物設計上比SSR技術簡單得多，無需預先知道DNA序列即可用引物對其進行擴增[14]。ISSR分子標記具有操作簡單，標記重復性好，穩(wěn)定程度高，多態(tài)性豐富等優(yōu)點，是一種非常理想的檢測三角梅種內遺傳變異的分子標記。

ISSR分子標記是基于PCR的標記，其反應結果受到諸如退火溫度、循環(huán)次數(shù)、模板DNA質量及濃度、Taq酶用量、引物濃度、dNTP濃度等多種因素的影響。因此，為了獲得重復性和可靠性較高的ISSR譜帶，在研究時都應建立起合適的反應體系并對其進行優(yōu)化，特別是第一次在某種生物上應用該項技術的時候。同時還應注意盡可能的使用統(tǒng)一廠家的藥劑和同一儀器設備才能保證分析結果的重復性和可靠性。

本試驗采用單因素試驗設計，逐一研究各因素不同處理水平對ISSR-PCR的影響，比較系統(tǒng)和精細地研究了各主要因子的影響，建立了三角梅ISSR-PCR優(yōu)化反應體系。同時，本研究為三角梅種質資源分析、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種等研究奠定了良好的基礎。

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