李永裕 陳建煙 關(guān)夏玉 溫鳳英 吳少華 王曾金

微波輔助提取余甘多糖的工藝研究

李永裕1，2陳建煙1，2關(guān)夏玉1溫鳳英1，2吳少華1，2王曾金1

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物天然產(chǎn)物研究所

余甘多糖具有清除自由基、抗氧化和抗腫瘤的生物活性，但對(duì)余甘多糖提取工藝的研究報(bào)道較少。該文采用微波前處理-熱水浸提新工藝提取余甘多糖，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)研究了微波時(shí)間、微波功率、熱水浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)余甘多糖得率的影響。結(jié)果表明，多糖得率的主要影響因素及其順序?yàn)椋簾崴釡囟?、熱水浸提時(shí)間、微波時(shí)間、微波功率。在所考察試驗(yàn)范圍內(nèi)，余甘多糖的最佳提取工藝條件為：微波時(shí)間60s、微波功率480W、熱水浸提溫度90℃、熱水浸提時(shí)間4h，在此條件下，余甘多糖得率為7.94%。

余甘多糖 微波輔助提取 正交試驗(yàn) 工藝條件

余甘（L.）是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（）植物，是世界衛(wèi)生組織指定在世界范圍內(nèi)推廣種植的3種保健植物之一[1]，1998年被我國(guó)衛(wèi)生部確定為藥食兩用植物。余甘起源于印度和緬甸，主要分布在印度、中國(guó)、緬甸、馬來(lái)西亞、巴基斯坦等南亞熱帶地區(qū)，以中國(guó)的產(chǎn)量最大[2]，在福建已成規(guī)?；耘唷，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，余甘具有抗腫瘤、抗衰老、抗突變、降血脂、降血壓、保肝、抑菌、抗炎等功效，全世界約有17個(gè)國(guó)家的傳統(tǒng)藥物體系用余甘果實(shí)進(jìn)行配伍，中國(guó)約有16個(gè)民族使用該藥[3]。有研究表明，余甘多糖具有清除自由基[4]、抗氧化和抗腫瘤的生物活性，可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5,6]，值得做進(jìn)一步的深入研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用[3]。為充分發(fā)揮地區(qū)優(yōu)勢(shì)，本課題組以余甘主栽品種“粉甘”果實(shí)為研究對(duì)象，探索低成本、高收率的余甘多糖提取工藝。

鄭寶東等[7]用熱水法研究了余甘多糖的提取工藝，但傳統(tǒng)的提取方法存在費(fèi)時(shí)、溶劑用量大、提取效率低等缺點(diǎn)[8]。近年來(lái)，微波輔助提取（MAE）技術(shù)在多糖提取工藝領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，受到人們的青睞，MAE技術(shù)具有溶劑消耗少、選擇性好、提取速度快、產(chǎn)品質(zhì)量好、可提高收率、提高提取純度及成本低等許多優(yōu)勢(shì)[8,9]。該技術(shù)在龍眼多糖、龍葵多糖、靈芝多糖、橘皮果膠等天然產(chǎn)物多糖的提取中已獲得了成功的應(yīng)用[8-11]。本文采用微波前處理與熱水浸提耦聯(lián)的新工藝提取余甘多糖，通過(guò)單因素考察及正交實(shí)驗(yàn)確立了有效的余甘多糖微波前處理-熱水浸提工藝，并證實(shí)了這一工藝的優(yōu)越性。本文的研究工作將為余甘多糖的工業(yè)化提取及應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮余甘果實(shí)采自福建省惠安縣紫山鎮(zhèn)藍(lán)田村。選擇無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)畸形的余甘果實(shí)，進(jìn)行清洗、去核、40℃烘干等前處理，干燥果肉用多功能粉碎機(jī)磨成粉末，過(guò)40目篩。參照Sun等[12]的方法，用80%乙醇70℃熱處理原料2次，除去單糖、低聚糖、色素和多肽等物質(zhì)，同時(shí)滅酶活防止酶在提取過(guò)程中對(duì)多糖的降解。抽濾，真空干燥，得到預(yù)處理余甘果肉干粉，置于-40℃冰箱中備用。

1.2 試劑及儀器

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、95%乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。本試驗(yàn)用水均為雙蒸水。

LibraS22紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（英國(guó)Biochrom公司）；AllegraTM64RCentrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BeckmanCoulter公司）；G80L20CSL-DG微波爐（廣州Galanz公司）；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏公司）；FDU-1200冷凍干燥機(jī)及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1多糖含量測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[13]。稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖60mg，定容至500mL，搖勻；分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL上述溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，順序加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸，振蕩搖勻顯色后放入冰水中冷卻。在波長(zhǎng)490nm處測(cè)量其吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖。繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=6.6444x+0.0432（R2=0.9974）。

13.2單因素試驗(yàn)

參照楊翠嫻等[8]和李順?lè)宓萚14]的方法，余甘果肉干粉用一定比例去離子水勻漿，置于微波爐中先進(jìn)行短時(shí)高頻微波前處理；微波前處理后的干粉加入一定比例去離子水后，在攪拌條件下采用熱水浸提，單因素試驗(yàn)時(shí)其它因素水平不變。提取液8000g離心10min，取上清液加入5倍體積的95%乙醇，靜置，8000g離心10min，最后沉淀用去離子水溶解并定容至100mL。吸取上述溶液2.0mL，于25mL比色管中，其余步驟同1.3.1。每組試驗(yàn)重復(fù)3-5次，取其平均值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算多糖得率。

多糖得率（%）=多糖提取量/余甘干粉重量×100

因素選擇：分別以不同微波功率、微波時(shí)間、熱水浸提時(shí)間和液料比作為多糖提取得率的影響因素。以傳統(tǒng)的熱水浸提方法[7]（料液比1∶20，100℃水浴5h）為對(duì)照。

1.3.3正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以微波功率、微波時(shí)間、熱水浸提時(shí)間和浸提溫度4因素，選9(34)表做正交實(shí)驗(yàn)，得出微波輔助提取余甘多糖的最佳工藝。選用因素及水平見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平選取

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1微波前處理工藝條件的影響

不同溶劑、微波功率和微波時(shí)間對(duì)提取率有明顯的影響[8,15]。由于目標(biāo)提取物為水溶性多糖，故選定提取介質(zhì)為水溶劑。在本試驗(yàn)中，固定后續(xù)熱水浸提工藝中的料液比為1∶20、浸提溫度90℃、浸提時(shí)間2h，分別考察不同微波前處理功率和處理時(shí)間對(duì)多糖收率的影響。

（1）微波功率：固定微波前處理時(shí)間為60s，考察不同微波前處理功率對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果表明（圖1），初期余甘多糖收率隨微波功率的增大而急劇增加，隨著微波輻射功率加大，多糖得率反而下降，這是因?yàn)檫^(guò)高的微波功率容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)快速失水，升溫過(guò)快，造成多糖結(jié)構(gòu)及活性的破壞[8]。

圖1　微波功率對(duì)多糖得率的影響

（2）微波作用時(shí)間：微波連續(xù)作用時(shí)間與試樣質(zhì)量、溶劑體積和微波功率有關(guān)，通常10~100s即可達(dá)到要求的萃取溫度[16]。在固定微波前處理功率為480W的條件下，本文考察了不同處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)微波前處理時(shí)間為60s時(shí)，余甘多糖的收率最高。過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間易引起溶劑溫度過(guò)高甚至暴沸，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物損失，收率降低[16]；同時(shí)，過(guò)多的輻射能量易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)中的部分乙?；⒘蝓ユI斷裂，改變其有機(jī)結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)像及生物活性，發(fā)生水解等不利反應(yīng)[8]。

圖2　微波前處理時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.2后續(xù)熱水浸提工藝條件的影響

余甘果肉干粉勻漿經(jīng)功率480W、時(shí)間60s的短時(shí)高頻微波前處理后，加入一定比例去離子水進(jìn)行熱水浸提，分別考察了后續(xù)熱水浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比對(duì)多糖收率的影響。

（1）熱水浸提時(shí)間：在料液比1∶20，溫度為90℃的恒溫水浴中分別浸提1h、2h、3h、4h、5h，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率顯著增加。在浸提時(shí)間為1~2h時(shí)，多糖得率由5.95%增加到7.03%，增加了18.17%（<0.01）；而在浸提時(shí)間為2h~5h內(nèi)，得率增加平緩，僅提高了7.54%，考慮到能耗，故選較優(yōu)浸提時(shí)間為2h。

圖3 熱水浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

（2）熱水浸提溫度：在料液比1∶20的條件下，控制浸提溫度為60、70、80、90、100℃的恒溫水浴中提取2h，測(cè)定結(jié)果如圖1。隨著浸提溫度的升高，多糖得率也逐漸增加，但溫度升高到90℃以后，多糖得率不再增加，反而有所下降，溫度過(guò)高可能會(huì)造成多糖的降解[17]，故選擇90℃為提取溫度較優(yōu)值。

圖4 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響

（3）料液比：在后續(xù)的熱水浸提實(shí)驗(yàn)中，料液比對(duì)余甘多糖提取率影響不顯著（圖5），因此本文在后面的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不考察液料比對(duì)微波輔助提取余甘多糖的影響。

圖5 料液比對(duì)多糖得率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

由于影響微波前處理和熱水浸提的微波功率、微波時(shí)間、熱水浸提時(shí)間和浸提溫度4個(gè)因素間能夠互相影響，因此本文在單因素水平試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，確定微波前處理-熱水浸提的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其極差分析見(jiàn)表2，各因素水平趨勢(shì)見(jiàn)圖6。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6　微波時(shí)間、微波功率、熱水浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

正交實(shí)驗(yàn)和極差分析結(jié)果表明：

①不同因素對(duì)多糖提取得率皆有影響。從圖6可見(jiàn)，采用微波時(shí)間60s，微波功率480W的短時(shí)高頻微波前處理余甘果肉，促使余甘果肉細(xì)胞破裂和多糖物質(zhì)浸出，多糖得率最高。后續(xù)用90℃熱水?dāng)嚢杞?，有效促進(jìn)了余甘多糖充分溶解于水中，多糖得率最高。在本文考察范圍內(nèi)，微波前處理-熱水浸提法的最佳浸提時(shí)間為4h，隨著浸提時(shí)間增加，多糖得率略有提高（圖3），但從經(jīng)濟(jì)角度考慮，浸提時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

②從表2的試驗(yàn)結(jié)果看出，在9組試驗(yàn)中4號(hào)試驗(yàn)的多糖得率最大，相應(yīng)的水平組合A2B1C2D3是當(dāng)前最好的水平搭配。

③4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響程度不同。從表2的極差值看出，4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)椋簾崴釡囟?熱水浸提時(shí)間>微波時(shí)間>微波功率，熱水浸提溫度（C）極差值最大是余甘多糖微波前處理-熱水浸提工藝的關(guān)鍵控制因素。

④以多糖得率為目標(biāo)，從4因素的水平趨勢(shì)看出，微波前處理-熱水浸提工藝的可能最佳水平組合為A2B2C2D3，即微波時(shí)間60s、微波功率480W、熱水浸提溫度90℃、熱水浸提時(shí)間4h，在此條件下進(jìn)行余甘多糖的提取，得率為7.94±0.15%，比組合A2B1C2D3的多糖得率7.60±0.29%略高。

3 結(jié)論與討論

采用微波前處理-熱水浸提新工藝提取余甘多糖，比傳統(tǒng)熱水浸提法[7]的多糖得率（6.17±0.19%）提高了28.54%，而且大大縮短了提取時(shí)間，節(jié)省成本。該工藝的優(yōu)勢(shì)在于先采用短時(shí)高頻微波前處理破裂余甘果肉細(xì)胞，再通過(guò)后續(xù)熱水浸提促進(jìn)余甘多糖的充分溶解，從而提高多糖提取率，而且微波處理不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)[10,18,19]。微波提取過(guò)程中，微波輻射能穿透萃取介質(zhì)，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞；進(jìn)一步加熱，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋?？锥春土鸭y的存在使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)多糖等胞內(nèi)物質(zhì)溶出[15,20]，同時(shí)微波所產(chǎn)生的電磁場(chǎng)加速了多糖的熱運(yùn)動(dòng)，縮短了其向溶劑界面的擴(kuò)散時(shí)間[21]；此外，微波對(duì)溶劑水分子的加熱作用可增加多糖的分散性，提高多糖物質(zhì)在水中的溶解度，促進(jìn)水不溶性多糖溶解于水[19,22]，提高了多糖的提取得率。

為進(jìn)一步優(yōu)化微波前處理-熱水浸提工藝，本文考察了微波前處理的微波功率及處理時(shí)間，以及后續(xù)熱水浸提溫度和浸提時(shí)間等4個(gè)重要影響因素對(duì)余甘多糖提取率的影響。正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)余甘多糖提取率的影響均達(dá)到極顯著水平。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，本文確定了在考察試驗(yàn)范圍內(nèi)的余甘多糖最佳提取工藝條件為：微波前處理功率480W，微波處理時(shí)間60s，熱水浸提溫度90℃，浸提時(shí)間4h。在此工藝條件下，余甘多糖得率達(dá)7.94±0.15%。其中，熱水浸提溫度是工藝的關(guān)鍵控制因素。本工藝研究對(duì)于余甘多糖的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的參考價(jià)值。

[1] Anilakumar K R, Nagaraj N S, Santhanam K. Reduction of hexachlorocyclohexane-induced oxidative stress and cytotoxicity in rat liver bygaertn [J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2007, 45 (5): 450-454.

[2] Perianayagam J B, Sharma S K, Joseph A, et al. Evaluation of anti-pyretic and analgesic activity ofGaertn [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 95 (1): 83-85.

[3] 李永裕, 吳少華, 溫鳳英, 等. 余甘生物學(xué)功能的作用機(jī)制研究(綜述) [J].熱帶作物學(xué)報(bào),2009,30(3):402-408.

[4] 肖湘,俞麗君,邱玉瑩,等.油柑多糖的提取與清除氧自由基作用研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1998,33(5):279-281.

[5] 鄭寶東,曾紹校.余甘多糖對(duì)小鼠的抗氧化作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,33(1):110-112.

[6] 曾紹校.余甘多糖提取工藝及其功能學(xué)的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004.

[7] 鄭寶東,曾紹校,鄭桂成.福建余甘可溶性多糖提取工藝研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2003,3(1):37-40.

[8] 楊翠嫻,李清彪,凌雪萍,等.應(yīng)用微波前處理-熱水浸提技術(shù)提取龍眼多糖[J].化工學(xué)報(bào),2007,58(8):2004-2009.

[9] 梁艷,應(yīng)苗苗,呂英華,等.微波輔助提取仙人掌多糖的工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(7):159-162.

[10] Chen X Q, Liu Q, Jiang X Y, et al. Microwave-assisted extraction of polysaccharides from[J]. Journal of Central South University of Technology, 2005, 12 (5): 556-560.

[11] Fishman M L, Chau H K, Hoagland P, et al. Characterization of pectin, flash-extracted from orange albedo by microwave heating, under pressure [J]. Carbohydrate Research, 1999, 323 (1-4): 126-138.

[12] Sun Y, Tang J, Gu X, et al. Water-soluble polysaccharides from(Oliv.) Diels: Preparation, characterization and bioactivity [J]. International journal of biological macromolecules, 2005, 36 (5): 283-289.

[13] 鄭少泉,姜帆,高慧穎,等.超聲波法提取龍眼多糖工藝研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(2):76-79.

[14] 李順?lè)?劉興華,張麗華,等.真姬菇子實(shí)體多糖的提取工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(2):281-284.

[15] 陳業(yè)高,海麗娜,畢先鈞.微波輻射在天然藥用活性成分提取分離中的應(yīng)用[J].微波學(xué)報(bào),2003,19(2):85-89.

[16] 張英,俞卓裕,吳曉琴.中草藥和天然植物有效成分提取新技術(shù)——微波協(xié)助萃取[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(2):104-108.

[17] 任初杰,高麗,吳謀成,等.堿提花生粕水溶性多糖工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(7):251-254.

[18] Navarro D A, Flores M L, Stortz C A. Microwave-assisted desulfation of sulfated polysaccharides [J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 69 (4): 742-747.

[19] Wang Q, Wood P J, Cui W. Microwave assisted dissolution of β-glucan in water-implications for the characterisation of this polymer [J]. Carbohydrate Polymers, 2002, 47 (1): 35-38.

[20] 江艷,王浩,呂龍,等.靈芝孢子粉多糖Lzps-1的化學(xué)研究及其總多糖的抗腫瘤活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(4):347-350.

[21] Camel V. Recent extraction techniques for solid matrices--supercritical fluid extraction, pressurized fluid extraction and microwave-assisted extraction: their potential and pitfalls [J]. Analyst, 2001, 126 (7): 1182-1193.

[22] Marconi E, Ruggeri S, Cappelloni M, et al. Physicochemical, untritional, and microstructural characteristics of chickpeas (L.) and common beans (L.) following microwave cooking [J]. Journal of Agricultural and Food.