王 婭 鄭 毅* 沈少娟 陳金聊

微生物輔酶Q10高產(chǎn)菌株理性選育

王 婭1鄭 毅1*沈少娟2陳金聊2

1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2.廈門金達(dá)威微生物研究室

輔酶Q10是一種新型的生化藥物，常作為保健品、食品以及化妝品的添加劑，在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，Q10的研究與開發(fā)越來(lái)越受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文概述了微生物輔酶Q10合成代謝途徑、代謝定向育種等方面的研究進(jìn)展。

輔酶Q10微生物 理性育種

輔酶Q10(CoQ10)又稱為泛醌，為2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的側(cè)鏈帶有10個(gè)類異戊二烯的衍生物，在真核細(xì)胞內(nèi)與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合，在原核細(xì)胞內(nèi)則存在于細(xì)胞質(zhì)膜中，是呼吸鏈的重要遞氫體[1]。它是細(xì)胞自身合成的天然抗氧化劑和細(xì)胞代謝的激活劑，具有提高機(jī)體免疫力的功能，因而是一種臨床價(jià)值很高的生化藥物。它可用于治療心臟病、胃潰瘍、病毒性肝炎；還具有抗腫瘤、治療圓形脫發(fā)和肺氣腫的功能；對(duì)艾滋病和帕金森癥有顯著的輔助治療[2]。在化妝品和保健品市場(chǎng)中，輔酶Q10對(duì)延緩衰老和提高機(jī)體免疫力有著不可代替的作用[3]。隨著生活水平的提高，近年來(lái)人們對(duì)它的需求量不斷攀升，從而促進(jìn)了輔酶Q10產(chǎn)品生物加工的發(fā)展

目前，輔酶Q10的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵法，受限于發(fā)酵的效價(jià)低，造成生產(chǎn)成本居高不下。本文主要對(duì)目前微生物輔酶Q10的研究現(xiàn)狀、高產(chǎn)菌株的選育思路以及發(fā)酵工藝控制方面進(jìn)行概述，為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

1 微生物法生產(chǎn)輔酶Q10

輔酶Q10的生產(chǎn)方法一般分為直接提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法等。直接提取法受到原材料輔酶Q10含量的限制且受原料及季節(jié)等的限制，提取成本高，不適合于現(xiàn)代化工業(yè)大生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法制得輔酶Q10為順反異構(gòu)體混合物，生物活性低，同時(shí)合成過程反應(yīng)復(fù)雜、步驟多、且轉(zhuǎn)化效率低、往往還存在許多副產(chǎn)物，這些因素都嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[4]。

微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)輔酶Q10的最主要生產(chǎn)方法。該生產(chǎn)方法由于原料廉價(jià)豐富，產(chǎn)物分離過程相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)物為天然品，不存在手性問題，生物活性好，易被人體吸收，且可以通過發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)規(guī)模化工業(yè)化生產(chǎn)，因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產(chǎn)方法。迄今為止，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的輔酶Q10產(chǎn)生菌大多為細(xì)菌[5-8]，表1列出主要的產(chǎn)輔酶Q10微生物。通常微生物發(fā)酵產(chǎn)生輔酶Q10的產(chǎn)量在30~130mg/L，據(jù)估計(jì)要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)輔酶Q10的產(chǎn)量應(yīng)該高于500mg/L[9]。日本是最早開發(fā)輔酶Ｑ10的國(guó)家，但從近幾年的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，中國(guó)正成為輔酶Q10原料藥的生產(chǎn)中心。

2 輔酶Q10高產(chǎn)菌株選育策略

2.1 應(yīng)用代謝調(diào)節(jié)理論推理選育高產(chǎn)菌

在對(duì)輔酶Q10生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制研究基礎(chǔ)上，利用代謝工程的定向選育高產(chǎn)菌株，優(yōu)化代謝途徑，可達(dá)到提高輔酶Q10發(fā)酵水平的目標(biāo)。目前主要代謝控制策略：(1)強(qiáng)化輔酶Q10組件的生物合成，即強(qiáng)化莽草酸途徑、MEP途徑與甲硫氮酸合成途徑；（2）切斷或減弱支路通量，解除其末端產(chǎn)物對(duì)輔酶Q10代謝流的分流與反饋抑制，例如莽草酸途徑也產(chǎn)生芳香族氨基酸、類胡蘿卜素等；（3）強(qiáng)化葡萄糖代謝流量，解除葡萄糖分解代謝阻遏，實(shí)現(xiàn)高濃、高效轉(zhuǎn)化。

表1 輔酶Q10主要產(chǎn)生菌

2.1.1選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

Olson和 Rudney[12]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜素合成和輔酶Ｑ10合成具有共同的前體，胡蘿卜素分支是輔酶Ｑ10合成中的一股強(qiáng)大的代謝流。胡蘿卜缺陷型菌株可以切斷β-胡蘿卜素的代謝流，從而增加與輔酶Ｑ10合成的共同前體GGPP的積累與供給，提高輔酶Ｑ10的產(chǎn)量。Hajime Yoshida等[9]獲得綠色突變株的Ｑ10胞內(nèi)含量比野生型提高3.6倍。研究表明，通過選育L-苯丙氨酸缺陷、蘇氨酸、L-酪氨酸缺陷或色氨酸缺陷等營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株以阻斷不必要的代謝支路，增加甲硫氨酸和SAM合成途徑中各酶基因尤其是限速酶的拷貝數(shù)及表達(dá)量，可以提高SAM的產(chǎn)量，為合成輔酶Ｑ10提供富足的前體[14]。

2.1.2選育抗反饋調(diào)節(jié)的突變株

（1）耐前體突變株選育

在輔酶Q10生物合成的中，每合成一分子產(chǎn)物需要一分子對(duì)羥基苯甲酸（PHBA），一分子聚異戊二烯焦磷酸（PPP），還需要S-腺苷蛋氨酸（SAM）和O2的供給，因此要提高輔酶Q10產(chǎn)量必須保證前體的協(xié)同供給。L-乙基硫氨酸是L-蛋氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，因此選育抗前體L-乙基硫氨酸突變株，可以解除蛋氨酸對(duì)高絲氨酸轉(zhuǎn)乙?；傅姆答佉种坪蛯?duì)胱硫醚裂解酶和轉(zhuǎn)甲基酶的阻礙，有利于輔酶Q10的大量積累。王普等[15]，對(duì)實(shí)驗(yàn)室自行篩選的輔酶Q10產(chǎn)生菌株—季也蒙假絲酵母() CG108進(jìn)行誘變，并結(jié)合L-乙基硫氨酸耐前體突變株的理性化篩選，獲得一株輔酶Q10高產(chǎn)菌株P(guān)N251。

（2）耐終產(chǎn)物突變株選育

選育抗類似物突變株是目前代謝控制育種的主要方向[16]。在輔酶Q10的合成途徑中，終產(chǎn)物可能抑制產(chǎn)物的大量合成。Vk3是輔酶Q10的結(jié)構(gòu)類似物，因此利用類似于Vk3等輔酶Q10結(jié)構(gòu)類似物來(lái)遺傳性的解除對(duì)代謝關(guān)鍵酶的抑制作用，使得在細(xì)胞中已經(jīng)有大量終產(chǎn)物的情況下仍能不斷合成所需產(chǎn)物。張向陽(yáng)等[17]，以根癌土壤桿菌() 突變株WSH2E01為出發(fā)菌株，通過進(jìn)一步的誘變處理，獲得-乙硫氨酸和維生素K3(VK3) 雙抗性突變株WSH2V01，與出發(fā)菌株WSH AT12 相比，突變株WSH2V01 在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到29. 5 mg/L 。

（3）解除葡萄糖分解阻遏突變株

當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度提高到一定濃度時(shí)，會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成，這可能是由于某些酶的合成被容易分解利用的碳源所阻遏。因此選育解除葡萄糖分解阻遏突變株，增加葡萄糖代謝通量，從而促進(jìn)了輔酶Q10的合成。

2.1.3應(yīng)用細(xì)胞毒性物質(zhì)篩選高產(chǎn)菌株

在培養(yǎng)基中添加放線菌素D、羅紅霉素等細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生脅迫毒害作用。由于輔酶Q10是一種能提高機(jī)體免疫力的生理活性物質(zhì)，篩選抗細(xì)胞毒性物質(zhì)的菌株，可以獲得高產(chǎn)輔酶Q10的菌株。此篩選模型大大加快了高產(chǎn)菌株的選育過程。潘春梅等[18]，以放射型根瘤菌()WSH2601為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，獲得遺傳穩(wěn)定性好的抗放線菌素D突變株WSH-F06。

在輔酶Q10的選育過程中，僅選用單一的一種育種策略是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。通常情況是基于廣譜性的選育手段（如通過紫外處理、輻射處理、細(xì)胞毒性物質(zhì)等[19]），再結(jié)合針對(duì)輔酶Q10某些合成途徑設(shè)計(jì)的選育模型進(jìn)行復(fù)合育種，從而獲得輔酶Q10高產(chǎn)菌株。

2.2 應(yīng)用代謝工程理論構(gòu)建輔酶Q10工程菌

利用基因工程理論改變細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)機(jī)制也是獲得高產(chǎn)菌種的一個(gè)重要策略。

2.2.1莽草酸途徑及代謝工程育種

基于對(duì)大腸桿菌代謝途徑的不斷探索和深刻認(rèn)識(shí)，以及菌體自身的優(yōu)良條件，目前對(duì)其進(jìn)行基因工程改造較為成功[20]。在大腸桿菌中，通過提高輔酶Q10合成途徑中基因的表達(dá)可以提高輔酶Q10前體的流通量，從而獲得大量的終產(chǎn)物。Barker[21]等通過選擇性地表達(dá)莽草酸途徑中的幾個(gè)酶，同時(shí)限制芳香族氨基酸的通量，使對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量達(dá)到了12g/L。

2.2.2聚異戊二烯焦磷酸合成（PPP）途徑及代謝工程育種

由于大腸桿菌主要是合成輔酶Q8，而通過基因工程原理改造輔酶Q10異戊二烯側(cè)鏈聚合的關(guān)鍵酶，從而使其大量合成輔酶Q10。Cheong等[22]將聚十異戊二烯焦磷酸(DPS ) 基因和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因一起插入載體pGPRX11中，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BNQ-pGPRX11-(KCCM-10554)中表達(dá)，得到輔酶Q10的高產(chǎn)菌，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化后產(chǎn)率達(dá)到6.69 mg/ g，工業(yè)化生產(chǎn)前景較好。

2.2.3甲基引入策略

大腸桿菌中，芳香環(huán)修飾的第一步是PHBA和PPP的縮合反應(yīng)，催化此反應(yīng)的酶是對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶（UbiA），此酶為膜結(jié)合蛋白，是生物輔酶Q10合成的限速步驟[12]。過量表達(dá)UbiA等相關(guān)基因可以使輔酶Q10的產(chǎn)量提高。

運(yùn)用基因工程原理進(jìn)行育種選育高產(chǎn)菌株可以獲得較好的效果，但是由于輔酶Q10代謝合成路徑復(fù)雜，所涉及到的基因繁多，研究工作較為緩慢，因此，還需要進(jìn)一步的深入研究。

3 展望

隨著輔酶Q10的需求量不斷攀升，越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者加入到研究輔酶Q10的行列。國(guó)外學(xué)者在利用基因工程改造菌種方面以及發(fā)酵過程中的條件控制方面做了許多研究。國(guó)內(nèi)的研究主要側(cè)重于利用傳統(tǒng)的誘變育種進(jìn)行菌種選育以及配方優(yōu)化方面，盡管獲得了一系列產(chǎn)量提高的突變株，但總體產(chǎn)量水平還達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。隨著輔酶Q10生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制的深入研究，應(yīng)用代謝工程的方法選育高產(chǎn)菌株，構(gòu)建工程菌株，改造原菌株，從而進(jìn)一步化化生產(chǎn)工藝。同時(shí)，輔酶Q10發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)控制相對(duì)復(fù)雜，如何簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝控制的中間環(huán)節(jié)，建立自動(dòng)化控制模式也是十分重要的。

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鄭毅。