劉源慧 鄭 毅 王 婭 鄧琳芬

米曲霉F16原生質體的制備和再生研究

劉源慧 鄭 毅 王 婭 鄧琳芬

福建師范大學生命科學學院

目的：研究菌齡、酶液組成、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑、培養(yǎng)基成分等因素對米曲霉F16原生質體制備和再生的影響。結果表明，米曲霉原生質體制備和再生的最佳條件是：菌齡15h，酶液為0.75%纖維素酶、0.75%蝸牛酶、0.5%溶菌酶的混合酶液，酶解時間2.5h，溫度為28℃，最適原生質體再生培養(yǎng)基為含有0.6mol/L NaCl的PDA培養(yǎng)基。

米曲霉 原生質體 制備 再生

米曲霉（）是一類產復合酶的菌株，生產的酶類包括蛋白酶，淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等[1]，在造紙、食品、飼料、生產曲酸、釀造等工業(yè)中應用十分廣泛。在實際生產中，米曲霉的產酶能力往往欠佳。如果能對米曲霉進行人工改造以提高其酶活,將會在一定程度上提高生產效率,降低生產成本。目前關于米曲霉的育種，主要采用物理和化學的誘變方法。自Emerson[2]首次報導得到粗糙脈孢菌的類原生質體結構以來,絲狀真菌原生質體的研究已經取得了長足的進步，廣泛運用于真菌遺傳學的理論研究和育種實踐。與之相關的原生質體誘變、融合、轉化等技術是如今行之有效的菌種選育方法,愈加受到人們的重視,已經有許多的成功報道[3-4]。然而原生質體制備和再生是與原生質體相關的生物技術的關鍵環(huán)節(jié)。因此本文對米曲霉原生質體的制備和再生條件進行研究，為基于原生質體技術基礎上的融合和基因組改組技術奠定夯實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

米曲霉F16為本實驗室保藏菌株

1.1.2 主要試劑

蝸牛酶(Snailase)；為廈門泰京生物有限公司產品；

纖維素酶(Cellulase),溶菌酶(Lysozyme)均為國藥試劑；

其他常規(guī)試劑均購自上海生工和中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司。

1.1.3培養(yǎng)基

（1）PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200；葡萄糖20；瓊脂 20；pH 6.8

（2）馬丁培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO41；MgSO4·7H2O 0.5；蛋白胨 5；葡萄糖 10；瓊脂 15-20；pH 6.8

（3）查氏培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30；NaNO33；KH2PO41；KCl 0.5；MgSO4·7H2O 0.5；FeSO40.001；麩皮10；瓊脂 15-20；pH 6.8

（4）PMA固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40；KH2PO41；NaNO32；KCl 0.5；FeSO40.01；MgSO4·7H2O 0.5；NaCl 38；瓊脂 15；酵母膏 2；PH 6.0

（5）酵母膏培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏5；蔗糖10；瓊脂粉15

（6）再生培養(yǎng)基：添加0.6mol/L的NaCl配制

1.2 方法

1.2.1菌絲體培養(yǎng)

從斜面上洗下的新鮮成熟孢子，調整孢子濃度在107個/mL，轉接入鋪有一層無菌玻璃紙的查氏固體培養(yǎng)基中，每皿接種量0.2mL，于28℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)數小時備用。

1.2.2酶液的配制

用0. 6mol/L NaCl或其它不同滲透壓穩(wěn)定劑配制,經0.22μ微孔濾膜過濾除菌,保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3原生質體的制備與再生

刮下玻璃紙上長好的菌絲體于50mL離心管中，加入10mL酶液,放置于適宜溫度的水浴振蕩器中進行酶解，并定時吸取少量酶解液用血細胞計數板計數。酶解完畢后，酶解液用4層無菌鏡頭紙過濾，除去菌絲體碎片，濾液3000r/min離心10min，除去上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑離心洗滌2次后重懸浮于適量滲透壓穩(wěn)定劑中，得到純化的原生質體[5]。用滲透壓穩(wěn)定劑對上述原生質體進行了稀釋,使之達到一定的濃度，取0.2mL接種于再生培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2d～3d。同時，取純化的原生質體用無菌水適當稀釋后放置30min，在未加入滲透壓穩(wěn)定劑的低滲固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，作為對照，計算再生率。

再生率=(再生固體培養(yǎng)基上菌落數-低滲固體培養(yǎng)基上菌落數)/原生質體數×100%

2 結果和討論

2.1 菌齡的選擇

微生物的生理狀態(tài)尤其是菌齡，是決定原生質體形成量的主要因素之一。絲狀真菌分離制備原生質體時常采用年輕的菌絲，一般認為對數前期和對數期效果最好。對于絲狀菌的原生質體再生來說，通常認為年輕細胞再生能力比衰老細胞要強。本實驗發(fā)現當米曲霉培養(yǎng)時間為15h時，原生質體的形成量最大，達到1.92×106個/mL,再生率最高值出現在13h時，達到22%（圖1）。綜合考慮，選擇15h的菌齡作為原生質體制備和再生的材料。

圖1 菌齡對原生質體制備和再生的影響

2.2 酶液組成的選擇

不同微生物由于其細胞壁成分不同，用于破壁的酶種類也不相同。霉菌細胞壁的結構及組成比較復雜，主要由纖維素、幾丁質組成。要想獲得大量具有活性的原生質體，首先要根據壁物質選擇合適的酶，其次酶的濃度也要適當，酶量過低，作用會不徹底，酶量過高，會影響原生質體的數量和活性。

2.2.1單一酶液對原生質體形成量的影響

分別單獨采用0.5%、1%、1.5%、2%的蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶找尋各自制備米曲霉原生質體時的最佳酶量。結果發(fā)現單獨使用蝸牛酶裂解米曲霉時，其最佳濃度為1.5%，單獨使用纖維素酶的時候最佳濃度也為1.5%，單獨使用溶菌酶的時候最佳濃度為1%。

2.2.2酶解液的復合配比對原生質體形成量的影響

上述單一酶對米曲霉原生質體的制備效果不甚理想，這可能是由于真菌細胞壁較復雜，而使用單一的酶不能有效水解其細胞壁?？紤]到裂解反應中各個酶之間的累積效應和各個酶之間可能存在的影響，選取各自最佳濃度的一半作為復合酶液中的基本濃度來進行混合，同時按照一定的步長擴充各個酶的取值范圍，以此尋求原生質體形成量最大時的酶濃度配比。結果表明制備米曲霉原生質體時以混合酶液的效果較好，其中第二組原生質體形成量最大（表1），故確定以0.75%蝸牛酶、0.75%纖維素酶、0.5%溶菌酶配制的混合酶液作為裂解液。

表1 酶液配比對原生質體制備的影響

2.2.3 酶解時間的選擇

酶液處理菌絲體細胞壁的過程是一個漸進的過程，隨著酶解時間的延長，原生質體的數量也會增加，但是如果裂解時間過長，原生質體的數量則會減少，并且對原生質體的再生也不利。在最佳酶液和菌齡條件下分別對不同酶解時間的原生質體進行計數及再生實驗。如圖2所示，酶解2.5h時原生質體的再生率最高，形成量也最大，可達3.5×106個/mL。

圖2 酶解時間對原生質體制備和再生的影響

2.2.4酶解溫度的選擇

溫度能影響菌絲體細胞壁的結構性疏散以及形成的原生質體的活力。研究不同溫度對米曲霉F16制備和再生的影響。結果如圖3，在28℃時原生質體的再生率最高，而生成量在30℃時最大，達到2.94×106個/mL。綜合考慮，本實驗采用28℃作為原生質體的酶解溫度。

圖3 酶解溫度對原生質體制備和再生的影響

2.2.5滲透壓穩(wěn)定劑的選擇

原生質體由于脫去細胞壁，對外界環(huán)境變化很敏感。滲透壓穩(wěn)定劑能夠為酶的溶解和原生質體的存在提供一個優(yōu)良的環(huán)境，防止原生質體的破裂，對原生質體具有穩(wěn)定和保護作用[6]。研究不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體形成數的影響，如圖4所示，0.6mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑的原生質體形成數最多，達2.8×106個/mL。

圖4 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體制備的影響

原生質體在蒸餾水或低滲的環(huán)境中容易破裂，所以再生培養(yǎng)基必須是高滲的。分別以0.6mol/L的NaCl、MgSO4.7H2O、KCl和蔗糖配制再生培養(yǎng)基，計算再生率，發(fā)現以0.6mol/L的NaCl配制的再生培養(yǎng)基上原生質體再生效果最好。

2.2.6再生培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基成分為菌株提供不同的營養(yǎng)條件和生長環(huán)境，Peberdy[7]等發(fā)現改變培養(yǎng)基成分可以獲得不同的原生質體產量，真菌的再生培養(yǎng)基中常常補加酵母膏、蛋白質、糖類等作為營養(yǎng)因子。分別以0.6mol/L的NaCl配制PDA、PMA、查氏、馬丁、酵母膏培養(yǎng)基作為再生培養(yǎng)基。結果發(fā)現培養(yǎng)基不同，其再生率有明顯差異。本實驗采用PDA作為原生質體的再生培養(yǎng)基，其再生率可達27%左右，效果最佳。

圖5 不同培養(yǎng)基成分對原生質體再生的影響

3 結論

錯綜復雜的菌絲細胞的生理狀態(tài)、去壁酶種類、濃度、作用時間都可能對原生質體的形成和再生產生影響。實驗結果表明，米曲霉菌株F16原生質體制備和再生的最佳條件為：菌齡15小時，裂解液為含0.75%蝸牛酶、0.75%纖維素酶和0.5%溶菌酶的混合酶液，溫度28℃、時間2.5h、0.6mol/LNaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，高滲PDA培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。此條件下的原生質體形成量大，再生效果好。在具體實驗操作中，還需要注意幾點：一是排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水，因為水分會降低滲透壓導致原生質體破裂；二是制備好的原生質體不能保存太久，最好現制現用；三，在用血球計數板進行顯微觀察時，最好減弱外置光源的強度，因為投射光過強，原生質體與背景顏色反差較小[8]，不利于觀察。

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[3] Reddy C R K, Dipakkore S, Kumar G R, et al. An imp roved enzyme p reparation for rapid mass production of protoplasts as seed stock for aquaculture of macrophytic marine green algae [J]. Aquaculture, 2006, 260: 290-297.

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[5] 張志光.真菌原生質體技術[M ]. 北京: 湖南科學技術出版社,2003.

[6] 張志光,由媛,全麗等.雙親滅活的原生質體融合株啤酒酵母DR9----2的構建及其特征的研究.釀酒，2007,34（5）:72-75.

[7] PEBERDY J F.In microbial and plant protoplasts [M].London:Academic Press,1976,39-50.

[8] 劉青,肖東光.一種觀察釀酒酵母原生質體的簡易方法[J].釀酒科技,2005,（6）:123-125.