鄧琳芬 鄭 毅 王 婭 劉源慧

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米曲霉產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

鄧琳芬 鄭 毅 王 婭 劉源慧

福建師范大學生命科學學院

對米曲霉產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。首先通過單因素試驗確定發(fā)酵最適碳源為玉米粉，最適氮源為蛋白胨，然后通過Plackett-Burman優(yōu)化選出對發(fā)酵影響最顯著的因素，分別為蛋白胨、橄欖油、Na2HPO4。產(chǎn)脂肪酶的最適培養(yǎng)條件為：玉米粉0.5%，蛋白胨5%，橄欖油1.5%，NaNO31%，Na2HPO40.25%，KCl 0.05%，MgSO40.05%，F(xiàn)eSO40.001%。

米曲霉 脂肪酶 發(fā)酵條件

脂肪酶廣泛應(yīng)用于脂肪的生產(chǎn)工藝、去污劑和脫脂業(yè)、食品、工藝、精細化學品合成業(yè)、造紙業(yè)、化妝品制造業(yè)以及制藥業(yè)中，脂肪酶還可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解，大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)的微生物脂肪酶是出自真菌和細菌的酶[1]。隨著對脂肪酶研究的日益深入,其應(yīng)用領(lǐng)域正日漸拓寬,與此相應(yīng),新型脂肪酶的研究開發(fā)就備受關(guān)注。通過對原有脂肪酶改性或?qū)赀M行優(yōu)化培養(yǎng)可以得到新型的脂肪酶[2]。本研究對一株米曲霉產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

米曲霉，為本實驗室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：0.2%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4,3%蔗糖,1.5%~2.0%瓊脂,1%麩皮.

種子培養(yǎng)基：0.5%玉米粉，0.5%葡萄糖，2%黃豆餅粉，0.5%酵母膏，1%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

初始設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基：1%玉米粉，4%黃豆餅粉，1%橄欖油，1%NaNO3，Na2HPO40.1%，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

1.2 方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)

將菌種由斜面接種到40mL（250mL的三角瓶）的種子培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min 的培養(yǎng)24h 制成液體菌種，然后按10％的接種量接入到40 mL（250 mL的三角瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，230 r/ min下進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 酶活測定方法

采用橄欖油底物乳化法[3]。加入5mL乳化橄欖油（4%PVA∶橄欖油=2∶1）及4mL0.05M的磷酸緩沖液（pH=7.5）于100mL小燒杯中，在37 ℃水浴鍋中預熱5min ，加入1 mL 酶液,反應(yīng)10 min ，加入15 mL濃度95 %乙醇，滴加3d酚酞，用0. 05 mol/ L NaOH 溶液滴定，記錄消耗的堿量V1 ?？瞻滓合燃右掖?，再加酶液，其余操作相同，此時消耗的堿量為V0。在此條件下，1min生成1μmol的脂肪酸定義為1個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的選擇

改變初始設(shè)計培養(yǎng)基中的碳源，分別以1％的玉米粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖、玉米淀粉、麥芽糖、甘露醇、糊精作為碳源，研究不同碳源對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明（圖1）：不同碳源對產(chǎn)酶影響較大，以蔗糖、葡萄糖、乳糖相對較好，玉米淀粉和甘露醇為碳源時產(chǎn)酶量最低，而以玉米粉為碳源時產(chǎn)酶量最高。玉米粉為最佳碳源，這與如王小花報道的蔗糖是最佳碳源的研究結(jié)果不同[2]。

圖1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

2.2 氮源的選擇

氮源分為無機氮源（硫酸銨、硝酸銨、尿素等）、有機氮源（如大豆粉、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白等）和復合氮源。一般認為復合氮源對微生物生長及產(chǎn)酶效果較好[4]。有機氮源一般比無機氮源要好, 如蛋白胨和酵母膏在細菌脂肪酶的生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛[5]。以1％的玉米粉為碳源，分別選用4％的黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉、1％的NaN03、NH4NO3作為氮源, 研究不同氮源對產(chǎn)酶的影響。試驗表明（圖2）：有機氮源為蛋白胨和酵母膏時，產(chǎn)酶量最高而且相當，選擇蛋白胨為有機氮源，無機氮源為硝酸鈉時產(chǎn)酶水平最佳。

圖2 氮源對產(chǎn)酶的影響

2.3 Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選重要因子

采用Plackett-Burman實驗設(shè)計對培養(yǎng)基配方各組分（包括玉米粉，蛋白胨，橄欖油，NaNO3，Na2HPO4，KCl，MgSO4，F(xiàn)eSO4）進行重要性篩選，確定對產(chǎn)酶影響顯著的因素。選擇N=12的8因素2水平的Plackett-Burman試驗設(shè)計，進行培養(yǎng)基優(yōu)化。以發(fā)酵培養(yǎng)基配方的不同組分作為優(yōu)化輸入因子，輸入因子A-K分別代表玉米粉，蛋白胨，橄欖油，NaNO3，Na2HPO4，KCl，MgSO4，F(xiàn)eSO4，其中輸入因子C、F、I為估計誤差設(shè)置的虛擬項，每項均取高（+1）低（-1）兩水平，見表1，響應(yīng)值Y為脂肪酶的酶活力，表中每列代表每種因素的不同水平。

表1 N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計方案及試驗響應(yīng)值

Plackett-Burman試驗的二水平分析目的：在其它因素不變的情況下，分析某因素的變化對響應(yīng)的影響，從而得出影響培養(yǎng)基組成的主效應(yīng)因素，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：培養(yǎng)基成分橄欖油, 蛋白胨以及Na2HPO4可信度均大于85%，為顯著因子，顯著性排序為橄欖油＞蛋白胨＞Na2HPO4。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平及顯著性

3 培養(yǎng)基顯著因子單因素優(yōu)化

3.1 蛋白胨對產(chǎn)酶影響

對培養(yǎng)基中蛋白胨的濃度進行優(yōu)化，結(jié)果（如圖3），由圖可知，在濃度由1%到5%之間，酶活隨濃度的升高而升高，在蛋白胨濃度為5%達到最高值，再升高濃度酶活基本保持不變。以蛋白胨濃度為5%最佳。

圖3 蛋白胨濃度對產(chǎn)酶的影響

3.2 橄欖油對產(chǎn)酶影響

對培養(yǎng)基中橄欖油的濃度進行優(yōu)化，結(jié)果（如圖4），由圖可知，濃度由0.25%到1.5%，酶活隨濃度升高而升高，1.5%時酶活達到最大，隨后酶活隨濃度升高反而降低。以橄欖油濃度為1.5%最佳。在試驗中，添加適量的橄欖油能夠提高產(chǎn)酶，說明發(fā)酵產(chǎn)的脂肪酶是誘導型脂肪酶。

圖4 橄欖油濃度對產(chǎn)酶的影響

3.3 Na2HPO4對產(chǎn)酶影響

對培養(yǎng)基中Na2HPO4的濃度進行優(yōu)化，結(jié)果（如圖5），由圖可知，酶活隨濃度升高而升高，當濃度為0.25%時酶活最大，隨后，隨濃度升高酶活有所下降。以Na2HPO40.25%濃度為最佳。

圖5 Na2HPO4濃度對產(chǎn)酶的影響

4 結(jié)論

4.1 單因素優(yōu)化結(jié)果表明，玉米粉為最佳碳源，蛋白胨為最佳有機氮源，NaNO3為無機氮源。

4.2 通過Plackett-Burman實驗從發(fā)酵培養(yǎng)基的8個組分中，篩選出對產(chǎn)酶影響最顯著的3個因素，分別是橄欖油、蛋白胨、Na2HPO4。

4.3 對培養(yǎng)基影響產(chǎn)酶3個組分進行單因素優(yōu)化，結(jié)果表明：蛋白胨濃度為5%，橄欖油濃度為1.5%，Na2HPO4濃度為0.25%，產(chǎn)酶水平最高。

[1] 王小芬,等.微生物脂肪酶的研究進展[J].科技導報,2006,24,(2):10-12.

[2] 王小花,洪楓,朱利民,陸大年.米曲霉產(chǎn)胞外脂肪酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(4):25-27.

[3] 鄔敏辰.堿性脂肪酶提取的探討[J].江蘇食品與發(fā)酵,1995,(4):4-8.

[4] 陶文沂,等.脂肪酶產(chǎn)生地酶7203菌株的分離和強度[J].微生物學報,1990,30(3):216-222.

[5] 彭立風.微生物脂肪酶的研究進展[J].生物技術(shù)通報,1999,(2):17-22.