鄭 毅 劉源慧 鄧琳芬

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響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉α-淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基

鄭 毅 劉源慧 鄧琳芬

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

應(yīng)用快速有效的響應(yīng)面分析法對米曲霉α-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。首先采用二水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基中的6種成份進(jìn)行篩選,獲得影響產(chǎn)酶的3個重要影響因子：豆粕粉、NaNO3、FeSO4；利用響應(yīng)面分析法對該3因素進(jìn)行3水平的優(yōu)化,獲得它們的最佳組合（g/L）:豆粕粉 25.5、NaNO34.08、FeSO40.0075。優(yōu)化后產(chǎn)酶水平達(dá)到1107.41U/mL，與響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值只有4.02%的誤差。

α-淀粉酶 Plackett- Burman設(shè)計(jì) 響應(yīng)面分析法

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一類酶的總稱，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1]。淀粉酶是生物工藝學(xué)中最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)的酶制劑品種，用途廣，產(chǎn)量大[1]。α-淀粉酶是淀粉酶的一種，其作用于淀粉時，可從分子內(nèi)部切開α-1，4鍵而生成糊精和還原糖，產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基C1碳原子為α-構(gòu)型，α-淀粉酶因此而得名[1]。α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，被廣泛地用于食品，發(fā)酵，紡織，造紙業(yè)，制藥業(yè)和化學(xué)藥品工業(yè)等工業(yè)，此外還擴(kuò)展到臨床，醫(yī)學(xué)，分析化學(xué)等其他領(lǐng)域。目前國內(nèi)主要利用細(xì)菌來生產(chǎn)α-淀粉酶，用真菌發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的研究較少[2]。

本研究報(bào)道利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)法Plackett – Burman和響應(yīng)面法（RSM）[3,4]快速優(yōu)化米曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 菌種

米曲霉()FS016，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 30、NaNO32、K2HPO4·3H2O 1、MgSO4·7H2O0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、麩皮 10、瓊脂10，初始pH為6.5，滅菌溫度121℃，滅菌時間23 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉 50、豆粕粉 20、NaNO34、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.01,初始pH為6.5，滅菌溫度121℃，滅菌時間23 min。

1.3 培養(yǎng)條件

由斜面接一環(huán)至 250 mL三角瓶中，培養(yǎng)基裝量 40 mL/250 mL，發(fā)酵溫度31℃，250rmin-1的搖床上震蕩培養(yǎng)84h后，測定α-淀粉酶活力。

1.4 α-淀粉酶活力的測定

YOO改良法[5],酶活定義為：在pH5.0，溫度55℃條件下，1 mL的酶液在5min內(nèi)水解1mg淀粉的酶量為一個活力單位，用U表示。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)優(yōu)化

選取6個因素、試驗(yàn)次數(shù)選12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，重復(fù)次數(shù)為2次，考查各因素的主效應(yīng)和交互作用的一級作用，從中篩選出對發(fā)酵優(yōu)化具有顯著性影響的因素進(jìn)行排列，最終獲得三個顯著性因素。

1.5.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

根據(jù)BOX-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，由Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出的3個重要影響因素各取三水平，設(shè)計(jì)了3因素3水平共15個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。

本實(shí)驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[6]。

以上所有試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為三次，每次兩個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基主要成分

選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對6個因素進(jìn)行考察，分別對應(yīng)于表1中A、B、D、E、G和H列，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”。另設(shè)2個虛擬序列，對應(yīng)表1中的C和F列，以考察試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

用SAS軟件的二水平設(shè)計(jì)分析各因素的主效應(yīng),結(jié)果見表2。各因素對產(chǎn)酶影響順序?yàn)?豆粕粉> FeSO4> NaNO3>玉米粉,利用響應(yīng)面分析對豆粕粉、NaNO3、FeSO43個培養(yǎng)基組分進(jìn)行更深入的研究。

表1 N = 12的 Plackett - Burman的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

（C）、（F）：虛擬列

表2 各因素的主效應(yīng)

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基

將Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定的3個重要因素,即豆粕粉、 FeSO4、NaNO3分別記為X1、X2、X3，以發(fā)酵酶活作為響應(yīng)值，記為變量Y，利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì),三因素各取3水平列表(見表3),設(shè)計(jì)了3因素3水平共15個試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的二次響應(yīng)面回歸（RSREG）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，參數(shù)值見表5，得到擬合二次回歸方程如下：Y=922.139933-5.133875000X1-15.381950000X2-15.933200000X3-44.37449167X1*X1-39.55369167X2*X2+76.29510833X3*X3+9.436200000X1*X2+35.56700000X1*X3+61.25020000X2*X3。

從表4可知，該模型計(jì)算出的擬合值與實(shí)驗(yàn)值較好吻合，平均擬合誤差只有1.29%。該模型可信度分析見表6。從表6可知，二次響應(yīng)面回歸模型是顯著，二次響應(yīng)面回歸模型是顯著（決定系數(shù)R2=0.9288）,模型擬合程度較理想,說明這3個因素及其二次項(xiàng)能解釋Y變化的92.88%,模型回歸P值為0.0210,回歸顯著,所以該模型可用于米曲霉產(chǎn)α-淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化的理論推測。

表3 三因素和三水平取值

表4 發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn) Box-Behnken設(shè)計(jì)矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實(shí)測值與擬合值

表5 參數(shù)估計(jì)表

表6 模型方程方差分析表

2.3 培養(yǎng)基最適組合

在獲得回歸非線性模型和響應(yīng)面以后，為了求得培養(yǎng)基最適濃度組合，對已回歸的非線性模型方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于0，得到了三元一次方程組，得到曲面的最大點(diǎn)。求解此方程組得到最大產(chǎn)酶水平的最佳培養(yǎng)基濃度組合：X1=-0.448(25.5g/L)；X2=-0.916(4.08g/L)；X3=-1(0.0075g/L)，預(yù)測值為1064.58U/mL，即產(chǎn)酶水平最高時的最佳培養(yǎng)基組成（g/L）：玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO34.08、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.0075,初始pH為6.5。

2.4 回歸模型的驗(yàn)證

以該法選出的最適培養(yǎng)基濃度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),發(fā)酵水平達(dá)到1107.41U/mL，試驗(yàn)值與模型計(jì)算值相差+4.02%，可見該模型可以較好地預(yù)測實(shí)際的發(fā)酵情況，說明響應(yīng)面分析法用于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是可行有效的[7]。

3 結(jié)論

對米曲霉F016α-淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)Plackett-Burman設(shè)計(jì)優(yōu)化確定三因素，并取三水平，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)矩陣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)后，進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析得到最佳培養(yǎng)基配方（g/L）：玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO34.08、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.0075,初始pH為6.5。 最終酶活力為1107.41U/mL，比初始水平提高了12.54%，α-淀粉酶酶活力有了顯著提高，達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目標(biāo)。

[1] 張樹政.酶工業(yè)制劑,下冊[M].北京:科學(xué)出版社,1998.

[2] AshokP .Poonam N ,et al.Advance in Microbial Amylase. Biotechnol. Appl. Biochem.2000.31:135-152.

[3] 歐宏宇,賈士儒. SAS軟件在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001,1(36):14-17.

[4] 王萬中.實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析.北京:高等教育出版社,2004.

[5] 史承利,姜涌明,蹙飚等.五種α—淀粉酶測活方法的比較研究[J].微生物學(xué)通報(bào),1995,22(1):23-24.

[6] 阮桂海.SAS統(tǒng)計(jì)分析實(shí)用大全[M].北京:清華大學(xué)出版社, 2005.

[7] 鄭毅,周彪等.產(chǎn)耐溫蛋白酶蘇云金芽孢桿菌FS140液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2007,13(5):708-712.