馮月蘭 徐國(guó)興 謝茂松

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合視黃酸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用

馮月蘭1、2徐國(guó)興1謝茂松1

1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科中心 2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科

目的：探討人類視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithe—lialium，hRPE)細(xì)胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合全反視黃酸（all-trans Retinoid Acid，RA）對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells.BMSCs)誘導(dǎo)分化的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分3組：RPE+RA+ BMSc共培養(yǎng)組,RPE+ BMSc共培養(yǎng)組,對(duì)照組。體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hRPE)和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSc),取第2代HRPE和第3代BMSCc接種于Transwell雙層培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)膠質(zhì)源性纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異性標(biāo)志物烯醇化酶(NSE)、光感受器特異性標(biāo)志視紫質(zhì)(Rhodopsin)在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組誘導(dǎo)BMSCs更多的表達(dá)GFAP (84.57士6.68)％，NSE(56.29士6.51)％,和Rhodopsin (41.47士3.76)％；與RPE培養(yǎng)上清液+BMSCs組及單獨(dú)BMSc組相比組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：RPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與視細(xì)胞分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 全反視黃酸 共培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化

BMSCs是來(lái)源于骨髓的非造血干細(xì)胞，具有多潛能分化特性。與存在倫理學(xué)爭(zhēng)議的胚胎干細(xì)胞及增殖能力有限的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，BMSCs以其具有自體同源性、易分離和操作簡(jiǎn)單等顯著優(yōu)勢(shì)，成為視網(wǎng)膜細(xì)胞移植治療的理想供體。已有研究表明，視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[1]。本研究旨在探討B(tài)MSCs誘導(dǎo)分化的條件培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)）；AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺(tái)（蘇州）；OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本）；OLYMPUS PMCB20攝影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均為Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、實(shí)驗(yàn)用體重為80g清潔級(jí)sD大鼠。培養(yǎng)基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；抗體為鼠抗人角蛋白-18單克隆抗體（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神經(jīng)元特異性標(biāo)志烯醇化酶（NSE），星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)，光感受器特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)，(均為T(mén)hermo Fisher Scientific公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 hRPE細(xì)胞的取材、原代、傳代培養(yǎng)及鑒定

采用眼杯消化法[2]，沿角鞏緣后3.5mm環(huán)形剖開(kāi)眼球，棄除眼前節(jié)、玻璃體及神經(jīng)視網(wǎng)膜獲得眼杯，用0.25%胰酶消化獲取HRPE細(xì)胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將第二代hRPE細(xì)胞置入六孔板中，孔板中放入18×18蓋玻片，利用免疫細(xì)胞化學(xué)EnVision法檢測(cè)角蛋白表達(dá)。

1.3.2 BMSCs的分離培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及鑒定

清潔級(jí)SD大鼠，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨，從股骨干和脛骨干中間剪斷，用10mLDMEM/F12培養(yǎng)液+20%FBS+肝素反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩過(guò)濾掉大的團(tuán)塊后充分吹打混勻獲取細(xì)胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，換液時(shí)倒除舊的培養(yǎng)液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培養(yǎng)液。當(dāng)?shù)?代MMSC細(xì)胞融合達(dá)80%~90%時(shí)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD44和CD90表達(dá)對(duì)細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定[3]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.1 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組：取二代hRPE細(xì)胞懸浮液含2000個(gè)細(xì)胞接種在transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將BMSCs接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2.0×103個(gè)細(xì)胞/孔，在雙層六孔板的每孔中加入終濃度為1μmol/L的RA，同時(shí)在下層放入18mm×18mm蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，隔天換液。（還是每日半定量換液）倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs組：取二代HRPE細(xì)胞懸浮液含2000個(gè)細(xì)胞接種在六孔transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將MSC接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2000個(gè)細(xì)胞/孔，同時(shí)在下層放入18 mm×18mm蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，隔天換液。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3 單獨(dú)BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出蓋玻片進(jìn)行GFAP，NSE， Rhodopsin，細(xì)胞化學(xué)染色。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

將雙層六孔板中爬有HRPE和誘導(dǎo)前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS潤(rùn)洗3min×3次；

4％多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室溫下處理l0min，PBS沖洗3min ×3次；

3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶PBS沖洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封閉非特異性結(jié)合，勿洗；

適當(dāng)稀釋度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3min ×3次；陰性對(duì)照片為用PBS 代替一抗；

二抗（生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體）37℃濕盒孵育30min，PBS沖洗；

DAB顯色6min；

蘇木素復(fù)染；

中性樹(shù)膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、傳代培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[2]、[3]報(bào)告的方法

2.2 誘導(dǎo)分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組共培養(yǎng)3d后原來(lái)梭行的BMSCs 胞體已發(fā)生收縮，呈錐形，細(xì)胞邊緣變得不規(guī)整，有零星的細(xì)的突起（圖1A）。在誘導(dǎo)后14d后，BMSCs 呈漸進(jìn)性的向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有較多的長(zhǎng)突起，有些長(zhǎng)突起末端形成生長(zhǎng)錐樣的膨大及絲性偽足呈典型的核周體形態(tài)，多極狀（圖1B）；同時(shí)BMSC在誘導(dǎo)7D后，部分細(xì)胞發(fā)生遷移并相互之間建立突觸聯(lián)系(圖1C)。與ｈRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組相比，不加RA則分化細(xì)胞明顯減少，也少有建立突觸聯(lián)系的細(xì)胞（圖1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；單獨(dú)BMSCs:D:×400；

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)分別對(duì)兩種誘導(dǎo)條件下GFAP、NSE、Rhodopsin表達(dá)進(jìn)行定量分析。

圖2 不同指標(biāo)與光密度關(guān)系

表1 不同誘導(dǎo)條件下光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3、表2。

圖3 不同指標(biāo)所表達(dá)陽(yáng)性率

表2 不同誘導(dǎo)條件下所表達(dá)指標(biāo)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

BMSCs是目前備受關(guān)注的一群具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。具有高度可塑性，在一定誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力。近年來(lái)，BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞的分化研究受到了極大的關(guān)注。本試驗(yàn)所用到的RA是一種維生素A的代謝產(chǎn)物，它可以影響脊椎動(dòng)物的發(fā)育和許多類型細(xì)胞的分化。RA常被用來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究，但機(jī)制尚不明確。RPE 細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子這些細(xì)胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一種多效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。對(duì)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的許多部位的神經(jīng)元具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)分化作用；bFGF能誘導(dǎo)體內(nèi)視網(wǎng)膜的重建，刺激所有源自中胚層的細(xì)胞以及許多源自神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞的增生；bFGF可介導(dǎo)神經(jīng)元的分化、對(duì)光感受器具有重要的保護(hù)作用；TGF2β可在正常RPE 細(xì)胞中表達(dá)?？烧{(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成。本試驗(yàn)將三者共培養(yǎng)兩周，結(jié)果顯示：BMSCs可以高表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志GFAP和NSE，同時(shí)我們還驚喜地發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的BMSCs表達(dá)光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)志Rhodopsin。這進(jìn)一步證明了，BMSCs不僅可以向非間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可以跨胚層由起始的中胚層向外胚層發(fā)育，這為臨床上進(jìn)一步治療視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病奠定了基礎(chǔ)。

[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 – 370.

[2] Xu GX．In Vitro Primary Culture ofHuman RPE[J]．Int J Opbtbalmol,2004：4(1)：l2.

[3] 謝茂松,徐國(guó)興等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J].國(guó)際眼科雜志,2007,7（5）:1285-1287.

福建省重點(diǎn)科研課題(基金編號(hào)：2008Y0040)。

徐國(guó)興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。