莊 華 徐國興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

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CTGF反義寡核苷酸對體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

莊 華 徐國興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

目的：研究結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)反義寡核苷酸對體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells, HLECs)合成CTGF與а-SMA表達(dá)的影響。方法：測算CTGF反義寡核苷酸對體外培養(yǎng)HLECs的轉(zhuǎn)染率；應(yīng)用CTGF反義寡核苷酸直接轉(zhuǎn)染第三代HLECs進行細(xì)胞生長曲線的測定；采用RT-PCR檢測細(xì)胞CTGF和α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) mRNA水平。結(jié)果：直接導(dǎo)入法反義寡核苷酸進入較慢，但導(dǎo)入72h后未出現(xiàn)細(xì)胞毒性。CTGF反義寡核苷酸直接導(dǎo)入HLECs培養(yǎng)細(xì)胞72h后可見對細(xì)胞增殖的抑制作用。直接導(dǎo)入法處理48h后，TGF-β1能顯著增加CTGF以及α-SMA mRNA的表達(dá)，但卻可被CTGF反義寡核苷酸所抑制。而錯義寡核苷酸卻沒有這種作用。結(jié)論：CTGF反義寡核苷酸直接轉(zhuǎn)染HLECs能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF與α-SMA表達(dá)上調(diào)，提示CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發(fā)性白內(nèi)障提供新途徑。

結(jié)締組織生長因子 晶狀體上皮細(xì)胞 反義寡核苷酸

后發(fā)障又稱為后囊膜混濁（posterior capsule opacification, PCO），是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，亦是白內(nèi)障術(shù)后視力下降的主要原因。白內(nèi)障術(shù)后殘留的HLECs在囊膜上轉(zhuǎn)分化、增生、移行，產(chǎn)生膠原，是發(fā)生后囊膜混濁的主要原因。這些轉(zhuǎn)分化的HLECs產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM），ECM是構(gòu)成纖維化混濁的重要成分，導(dǎo)致了纖維化斑塊的形成，最終導(dǎo)致后發(fā)性白內(nèi)障。在此過程中，殘留的LECs表達(dá)α-SMA。α-SMA正常表達(dá)于平滑肌與心肌，晶狀體中出現(xiàn)α-SMA為后發(fā)障的標(biāo)志，因此，α-SMA可作為HLECs轉(zhuǎn)分化的指標(biāo)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β, TGF-β1）能促進HLECs發(fā)生纖維化。TGF-β1除了致纖維化作用外，尚有抗增殖，抗炎等重要功能，長期抑制TGF-β1的活性將對機體產(chǎn)生不利影響。TGF-β1下游的效應(yīng)因子作為治療的靶點將更具有實用價值。CTGF作為TGF-β1的下游因子，特異地受TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)，介導(dǎo)了TGF-β1部分的促纖維化效應(yīng)。CTGF誘導(dǎo)HLECs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并表達(dá)а-SMA。轉(zhuǎn)分化的LECs可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，進而導(dǎo)致囊下混濁的發(fā)生。

反義寡核苷酸技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種根據(jù)堿基互補原理，通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)運、成熟和翻譯、誘導(dǎo)特異性核酸酶產(chǎn)生等機制對特定的靶基因表達(dá)產(chǎn)生阻滯，從而抑制或封閉異?；蚋弑磉_(dá)的基因，使其喪失活性，達(dá)到基因調(diào)控的目的。本研究通過體外細(xì)胞實驗，CTGF反義寡核苷酸干預(yù)細(xì)胞生長，初步探討CTGF在白內(nèi)障發(fā)生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司），Trizol Reagent（美國Fermentas公司），Taq PCR MasterMIX（美國Fermentas公司），PCR引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司），人重組轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）（美國Pepro Tech INC公司），陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），CTGF反義寡核苷酸和錯義寡核苷酸（上海英駿生物技術(shù)有限公司），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），HLECs來自HLEC-B3細(xì)胞株（美國ATCC細(xì)胞庫）

1.1.2引物及寡核苷酸序列

1.1.2.1 PCR引物

根據(jù)Pubmed上各因子mRNA全長序列由Invitrogen Biotechnology公司設(shè)計、合成（上海英駿生物技術(shù)有限公司），序列如下：

CTGF：上游5’- AAATCTCCAAGCCTATCAAG -3’；下游5’- TTCATGCCATGTCTCCGTACA-3’；擴增cDNA片段長度為270bp。

α-SMA：上游5’- AGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGC-3’；下游5’- CTCTCTGTCCACCTTCCAGCAG-3’；擴增cDNA片段長度為199bp。

β-actin：上游5’-GCATCCTGACCCTGAAGTACC-3’；下游5’- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3’；擴增cDNA片段長度為523bp。

1.1.2.2 寡核苷酸序列

CTGF反義寡核苷酸（antisence oligonucletide, ASON）和錯義寡核苷酸（scrambled oligonucletide, SC）：

根據(jù)人CTGFmRNA的全長序列和文獻(xiàn)由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，全部硫代磷酸化修飾，寡核苷酸還進行5’-異硫氰酸熒光素(5’-FITC)標(biāo)記，序列如下：CTGF反義寡核苷酸(AS)：5’-TACTGGCGGCGGTCAT-3’全部硫代磷酸化修飾，部分5’-FITC標(biāo)記；CTGF錯義寡核苷酸(SC)：5’-GGTCTAGCTTGCGGAC-3’全部硫代磷酸化修飾。

1.2 方法

1.2.1反義寡核苷酸的導(dǎo)入：將HLECs按1×105/mL的密度接種于6孔板，用含5% FCS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)，待細(xì)胞亞融合時，改為含2% BSA的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。（1）脂質(zhì)體包裹法：將4μg的反義寡核苷酸與10μL的脂質(zhì)體混合，室溫放置15 min后加入到培養(yǎng)液中，作用3h、6h。（按Lipofectamine2000使用說明書進行操作）。（2）直接導(dǎo)入法：將4μg反義寡核苷酸直接加入培養(yǎng)液中混勻，作用24h，48h，72h。上述兩法的細(xì)胞液避光。用無血清DMEM/高糖洗細(xì)胞數(shù)次，熒光顯微鏡觀察FITC綠色熒光，隨機選擇20個視野計算陽性細(xì)胞數(shù)，以同一視野下熒光顯微鏡與光鏡觀察到的細(xì)胞數(shù)之比計算導(dǎo)入率。（3）反義寡核苷酸以30μg/mL的濃度直接導(dǎo)入HLECs中，測定反義寡核苷酸導(dǎo)入48h后的導(dǎo)入率。

1.2.2 CCK-8比色實驗檢測反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法對體外培養(yǎng)的HLECs增殖活力的影響

細(xì)胞以每孔5000個細(xì)胞的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后實驗組加入含濃度為30μg/ml無5’-FITC標(biāo)記反義寡核苷酸的、含8%FCS的DMEM/高糖培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加100μL的8%FCS的DMEM/高糖培養(yǎng)基以及10μL的CCK-8溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h，酶標(biāo)儀測450nm光吸收值。

1.2.3 RT-PCR檢測CTGF反義寡核苷酸對體外培養(yǎng)的HLECs CTGF及α-SMA基因表達(dá)的影響

將體外培養(yǎng)的第三代HLECs按2×105/mL的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合時，改為無血清DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到同步。

分組：(1)正常對照組(C組)：用DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用48h；(2)TGF-β1組(T組)：用含TGF-β110ng/mL DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用48h；(3)反義寡核苷酸組(T+AS組)：用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL反義寡核苷酸的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用48h；(4)錯義寡核苷酸組(T+SC組)：用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL SC的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用48h。

RT-PCR(兩步法)：PBS洗滌各組細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中加入TRIzol RNA提取液，按說明書步驟提取總RNA，按RT-PCR試劑盒操作，總反應(yīng)體積為20μL。CTGF反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，擴增94℃ 30s，53℃ 45s，72℃ 45s，30個循環(huán)，最終延伸72℃ 7min。α-SMA反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，擴增94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 45s，30個循環(huán)，最終延伸72℃ 7min。β-actin反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，擴增94℃ 30s，59℃ 45s，72℃ 45s，30個循環(huán)，最終延伸72℃ 7min。取PCR產(chǎn)物，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像，用圖像分析處理系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）進行灰度掃描，以灰度值代表其表達(dá)量。用β-actin的量校正，將二者灰度值的相對量進行分析。

2 結(jié)果

2.1 Lipofectamine-反義寡核苷酸復(fù)合物的導(dǎo)入效率的檢測結(jié)果

脂質(zhì)體導(dǎo)入法6h見此時細(xì)胞變圓，貼壁不良，顯示出脂質(zhì)體的毒性作用。脂質(zhì)體導(dǎo)入法3h，6h導(dǎo)入細(xì)胞陽性率分別為41%，85%。脂質(zhì)體導(dǎo)入6h，可以顯著增加反義寡核苷酸的導(dǎo)入（P<0.05），但已對細(xì)胞有毒性作用。

2.2 反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法效率的檢測

直接導(dǎo)入法24h的導(dǎo)入率較低，為23%，表現(xiàn)為多數(shù)細(xì)胞僅僅細(xì)胞膜染色。48h和72h組導(dǎo)入率增加，分別為63%和66%，后兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。直接導(dǎo)入法培養(yǎng)72h后，細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯毒性作用。30μg/mL反義寡核苷酸48h轉(zhuǎn)染率達(dá)75%。

2.3 CCK-8比色實驗檢測反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法對體外培養(yǎng)的HLECs增殖活力的影響

SPSS軟件統(tǒng)計分析：24h組對照組與實驗組無顯著性差異（P>0.05）；48h組對照組與實驗組無顯著性差異（P>0.05）；72h組對照組與實驗組有顯著性差異（P<0.05），實驗組細(xì)胞增殖受明顯抑制；見表1。

表1 反義寡核苷酸對HLECs增殖活力的影響

2.4 RT- PCR檢測CTGF反義寡核苷酸對體外培養(yǎng)的HLECs CTGF及α-SMA mRNA表達(dá)的影響

CTGF反義寡核苷酸作用48h，可以大部分抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達(dá)，而錯義寡核苷酸不能抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達(dá)（圖1、圖2，表2、表3）。

圖1 CTGF mRNA在HLECs的表達(dá)

表2 不同處理組HLECs CTGF mRNA的表達(dá)情況（%,± s）

注：與FSM組比較：*P＜0.05；與T+AS組比較：#P＜0.05；與T組比較：◆P＞0.05。

圖2 α-SMA mRNA在HLECs的表達(dá)

表3 不同處理組HLECs α-SMA的表達(dá)情況（%,± s）

注：與FSM組比較：*P＜0.05；與T+AS比較：#P＜0.05；與T組比較：◆P＞0.05。

3 討論

后囊膜混濁是當(dāng)前白內(nèi)障摘除術(shù)后影響視力恢復(fù)的最主要并發(fā)癥之一[1-2]，其發(fā)生率一般在術(shù)后5年成人為50%，嬰幼兒可達(dá)100%。目前后發(fā)障的治療包括藥物治療和手術(shù)治療。藥物可使用多種抗代謝藥物如：秋水仙堿、裂霉素C(MMC)、5-Fu、柔紅霉素等，抗代謝藥能明顯抑制LECs生長，但由于這些藥物缺乏細(xì)胞特異性，對周圍組織毒性較大，給臨床使用帶來不便。隨著反義寡核苷酸進入PCO治療研究領(lǐng)域中，國內(nèi)學(xué)者劉宏偉、李長福等分別進行了bFGF和bcl-2的反義寡核苷酸對HLECs增殖活性的影響研究。Kampmeier等利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將反義細(xì)胞周期蛋白G1與反義MAT1分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胚胎HLECs，通過特異性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白G1與MAT1的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖活性，并觀察到細(xì)胞停滯于G1期，而且凋亡細(xì)胞的數(shù)目有顯著性增加，提示反義基因治療防治PCO可能是一種新的有效的治療方法。

在RT-PCR實驗中，我們用10ng/mL TGF-β1直接轉(zhuǎn)染48h可引起CTGF mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)顯著升高，說明TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)CTGF和α-SMA mRNA的表達(dá)。但是這種誘導(dǎo)作用在反義寡核苷酸組中，被30μg/ml的CTGF反義寡核苷酸所阻斷，表明反義寡核苷酸可以在mRNA水平上阻斷TGF-β1對CTGF與α-SMA表達(dá)的誘導(dǎo)作用[3]；在錯義寡核苷酸組中，CTGF mRNA、α-SMA mRNA的表達(dá)水平與TGF-β1組無顯著性差異(P>0.05)。實驗結(jié)果說明CTGF反義寡核苷酸特異地抑制了TGF-β1促HLECs轉(zhuǎn)分化的作用。TGF-β1刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)分化通過了CTGF途徑，CTGF介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA合成，是TGF-β1的部分生物學(xué)功能的下游調(diào)節(jié)因子。

在對HLECs進行體外實驗時，我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體短時間就可以提高HLECs的轉(zhuǎn)染率，然而培養(yǎng)6h后出現(xiàn)了細(xì)胞毒性反應(yīng)，細(xì)胞貼壁不良，形態(tài)變圓，少數(shù)細(xì)胞已死亡并漂浮于培養(yǎng)基中。直接轉(zhuǎn)染法24h轉(zhuǎn)染率偏低；然而48h轉(zhuǎn)染已可接近高峰，63%細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小熒光顆粒。CCK-8測定反義寡核苷酸（30μg/mL）對細(xì)胞生長的影響可發(fā)現(xiàn)24h組和48h組對照組與實驗組并無顯著性差異(P>0.05)，提示反義寡核苷酸（30μg/mL）小于48h的轉(zhuǎn)染對細(xì)胞生長并無太大影響；72h對照組與實驗組有顯著性差異(P<0.05)說明在轉(zhuǎn)染達(dá)72h后，該濃度的反義寡核苷酸開始抑制HLECs的增殖。

通過體外實驗，我們證實了CTGF反義寡核苷酸在抑制HLECs增殖的作用和抑制TGF-β1的轉(zhuǎn)分化作用。由于CTGF生物學(xué)效應(yīng)相對單一，主要介導(dǎo)促細(xì)胞增生和ECM合成以及組織纖維化作用[4]。CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發(fā)性白內(nèi)障提供新途徑。

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[3] Guo Haike. Effect of TGF-β1on proliferation of rabbit lens epithelial cells and expression of connective tissue growth factor[J]. Chin Ophthal Res, 2006,(24): 5-8.

[4] Abou-Shady M, Friess H, Zimmermann A, et al. Connective tissue growth factor in human liver fibrosis[J]. Liver, 2000, 20 (4): 296-304.

1.國家自然科學(xué)基金重點項目（基金編號：60827002）；2.福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金課題（基金編號：2006-js6033）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。