鄭紹斌 徐國興 林泰南 張曉娟 黃曉敏

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兔角膜中央厚度與角膜上皮厚度的相關(guān)研究

鄭紹斌1徐國興1林泰南2張曉娟1黃曉敏1

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科準(zhǔn)分子激光中心 2.福建省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院

目的：探討兔的角膜上皮厚度在A型超聲下與共焦下測(cè)量結(jié)果的相關(guān)性，及表麻藥對(duì)角膜上皮的作用。方法：分析左右眼之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別后，將20只兔子隨機(jī)分為兩組，一組滴用表麻藥為實(shí)驗(yàn)組，另一組點(diǎn)用平衡液作為對(duì)照組，分析表麻藥對(duì)角膜上皮的影響；最后將對(duì)照組用同樣方法處理后，將40只眼的角膜上皮在A超下與共焦下的測(cè)量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：（1）兔的眼別與角膜中央厚度的測(cè)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）滴用倍諾喜表麻液與滴用平衡液兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（3）A超下測(cè)量角膜中央厚度與角膜上皮厚度，二者呈正相關(guān)；（4）A超下與共焦下的測(cè)量的角膜上皮厚度呈正相關(guān)。結(jié)論：倍諾喜表麻液會(huì)使角膜上皮厚度增加,可使角膜上皮的松解，可以縮短乙醇浸泡角膜上皮的時(shí)間；A超下測(cè)量角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚；A超下測(cè)量角膜上皮越厚，其共焦下測(cè)量角膜上皮也越厚。

兔 角膜上皮厚度 A型超聲 共焦顯微鏡

活體的角膜中央厚度（CCT）的測(cè)量方法有A型超聲波角膜測(cè)厚儀、UBM、光學(xué)裂隙燈測(cè)厚儀、眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描、Orbscan裂隙掃描角膜地形圖/角膜測(cè)厚系統(tǒng)及共焦顯微鏡等,其中超聲角膜測(cè)量法是為準(zhǔn)確的測(cè)量方法。我們用超聲測(cè)量法測(cè)量CCT。這些方法現(xiàn)多用于臨床測(cè)量,而測(cè)量死后角膜厚度的方法目前報(bào)道很少?；铙w的角膜通過普通切片來測(cè)量將會(huì)產(chǎn)生很大的誤差,因?yàn)樵谥破^程中的脫水會(huì)造成角膜的皺縮，從而影響角膜測(cè)量的準(zhǔn)確性。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)兔的活體與死體角膜上皮之間關(guān)系的相關(guān)性研究；以及表麻藥物對(duì)角膜上皮影響的研究，為以后更廣泛地應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器材料

四川大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康新西蘭大耳白兔20 只40 眼。兔齡3~4月；重量1.9~2.2kg；,雌雄兼用；經(jīng)裂隙燈檢查均無眼前節(jié)病變。

A型超聲角膜測(cè)厚儀（DGH.technology INC.exton.PA.USA），美國思博明科學(xué)器材公司，在共聚焦顯微鏡圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行角膜厚度測(cè)量。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)本身載物臺(tái)標(biāo)本移動(dòng)距離測(cè)量角膜上皮厚度。

0.4%倍諾喜滴眼液（日本參天制藥株式會(huì)社）。

1.2 手術(shù)方法及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，耳緣靜脈注射水合氯醛后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1只眼作為實(shí)驗(yàn)組，另1只眼作為對(duì)照 組。再對(duì)20只兔采用區(qū)組隨機(jī)法,分成2組,每組10只。A型超聲角膜測(cè)厚儀測(cè)量中央角膜厚度各3次取平均值。

1.3 組織病理學(xué)研究

取材固定：用顯微鑷于兔的角膜中央固定區(qū)取直徑約6mm的角膜上皮,立即測(cè)量去上皮角膜厚度，同時(shí)標(biāo)本固定于4%中性甲醛中4 h,常規(guī)脫水、角膜上皮沿中央剪開，豎立石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片,常規(guī)HE染色，直接用共聚焦圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行角膜上皮厚度測(cè)量。

1.4 圖像分析

圖像分析系統(tǒng)對(duì)HE染色標(biāo)本進(jìn)行角膜上皮測(cè)厚。上皮厚度的計(jì)算方法是取切削區(qū)中點(diǎn)、邊界點(diǎn)以及兩點(diǎn)之間的中心點(diǎn),共5個(gè)點(diǎn),上端起于上皮表面,下端止于基底膜上,平均值即為角膜上皮厚度。

2 步驟

2.1 水合氯醛自兔耳緣靜脈注入，待兔進(jìn)入全麻狀態(tài)后，乙醇消毒鋪巾，用復(fù)方乳酸林格液做溶劑的8%妥布霉素溶液沖洗結(jié)膜囊。

2.2 測(cè)量角膜厚度統(tǒng)一用A超，點(diǎn)一滴表麻藥（0.4%倍諾喜）于結(jié)膜囊內(nèi)（約2cm高度）60秒后進(jìn)行，測(cè)三次結(jié)果取平均值。

2.3 將新鮮配制的濃度為20%的乙醇溶液（lmL純度為99.7%的無水乙醇中加入4.0mL注射用蒸餾水）0.15mL置于上皮環(huán)鉆內(nèi)，浸潤(rùn)時(shí)間25s后，吸血海棉吸干乙醇，BSS立即充分沖洗，避免損傷上皮。同時(shí)A超角膜測(cè)厚儀立即測(cè)量去上皮后的角膜中央厚度。

2.4 取下的角膜和角膜上皮片固定:在4℃下，4%的甲醛溶液中固定4小時(shí)（4℃），0.1mol/L的磷酸緩沖液中漂洗1小時(shí)(換液3次)。再逐級(jí)脫水：60%乙醇 (20分鐘)，70%乙醇 (20分鐘)，80%乙醇 (20分鐘)，95%乙醇 (25分鐘)，無水乙醇 (25分鐘)，二甲苯（20分鐘），浸蠟，包埋。角膜上皮及角膜平鋪，顯微鏡下沿中央剪開，豎立包埋角膜上皮及角膜后，縱向切片5μm厚連續(xù)切片。

2.5 切片組織蘇木素—伊紅(HE)染色，共聚焦顯微鏡下圖像分析系統(tǒng)測(cè)量角膜上皮厚度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)處理軟件包。組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，組內(nèi)各小組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用檢驗(yàn)及二元變量相關(guān)分析。以<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 未麻時(shí)左右眼A超的角膜厚度值結(jié)果如下（n=20，單位：μm）：

右眼 左眼 t P 357.55±16.5 350.50±13.02 2.27 0.128

3.2 滴用倍諾喜表麻液（實(shí)驗(yàn)組）與滴用平衡液組（對(duì)照組）結(jié)果如下（n=20，單位：μm）：

倍諾喜組 平衡液組 t P 360.75±17.53 351.30±15.76 1.79 0.041

P＝0.041＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說明表麻液可使角膜上皮厚度增加。

3.3 A超下角膜中央厚度與角膜上皮厚度的測(cè)量值如下（n=40，單位：μm）：

角膜中央厚度 角膜上皮厚度 r p 348.50±19.02 25.00±5.50 0.579 0.037

采用二元變量相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.579，P＝0.037，說明二者呈正相關(guān)；即A超下的角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚。

3.4 A超下與共焦下的角膜上皮厚度的測(cè)量值如下（n=40，單位：μm）：

A超下 共焦下 r p 25.00±5.50 16.56±6.93 0.593 ＜0.001

采用二元變量相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.593，P<0.001，說明二者呈高度相關(guān)；即A超下的角膜上皮越厚，共焦下的角膜上皮越厚。

4 討論

許多實(shí)驗(yàn)和臨床現(xiàn)象都說明滲透壓對(duì)于維持角膜處于一個(gè)脫水狀態(tài)是一個(gè)不可缺少的因素[1]?；铙w角膜之所以能夠始終保持透明和相對(duì)脫水狀態(tài),是通過角膜內(nèi)皮細(xì)胞的主動(dòng)的代謝性液泵作用和把房水與角膜基質(zhì)隔開的機(jī)械性屏障作用來實(shí)現(xiàn)的。人體或動(dòng)物死亡后角膜內(nèi)皮進(jìn)入到基質(zhì),使得基質(zhì)層腫脹,而基質(zhì)層占角膜厚度的90% ,故而使角膜增厚,透明度下降；活體的角膜厚度的測(cè)量方法有很多種, 如A型超聲波角膜測(cè)厚儀、UBM、光學(xué)裂隙燈測(cè)厚儀、眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描、Orbscan裂隙掃描角膜地形圖/角膜測(cè)厚系統(tǒng)及共焦顯微鏡等。其中超聲波角膜測(cè)量法是較為準(zhǔn)確的測(cè)量方法[2，3]。我們用超聲測(cè)量法測(cè)量CCT。這些方法現(xiàn)多用于臨床測(cè)量,而測(cè)量死后角膜厚度的方法目前報(bào)道很少?；铙w角膜通過普通切片來測(cè)量將會(huì)產(chǎn)生很大的誤差,因?yàn)樵谥破^程中的脫水會(huì)造成角膜的皺縮，從而影響角膜測(cè)量的準(zhǔn)確性。因此，我們將角膜上皮剝離后立即置于4%甲醛中固定。我們通過對(duì)兔的活體與死體角膜上皮之間關(guān)系的相關(guān)性研究，為以后更廣泛地應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

我們?cè)趯?duì)各組左眼、右眼角膜中央厚度比較，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（成組T檢驗(yàn)），發(fā)現(xiàn)左右眼角膜中央厚度沒有顯著差別，說明在該研究中眼別的影響不大。這與多數(shù)學(xué)者研究報(bào)道相似?，F(xiàn)多數(shù)研究報(bào)道CCT與性別，年齡無顯著性意義[3，10]。故我們就不對(duì)CCT與性別、年齡之間關(guān)系進(jìn)行研究，直接對(duì)成年雌雄兔研究。

對(duì)于LASEK手術(shù)，其優(yōu)勢(shì)是要制作高生物學(xué)活性的角膜上皮瓣[4]，多數(shù)學(xué)者[5，6，7，8]現(xiàn)較一致認(rèn)為20%乙醇作用于角膜上皮細(xì)胞的浸潤(rùn)時(shí)間應(yīng)為20~30 s，在本實(shí)驗(yàn)中我們浸泡時(shí)間亦為25s。Espana[9]等人用免疫熒光染色的方法研究浸潤(rùn)于20％乙醇20～25s后并施以LASEK 手術(shù)的角膜上皮瓣。得出結(jié)論：乙醇浸泡后制作出的上皮瓣，其分離層面位于上皮基底膜的透明層和致密層之間。我們對(duì)于倍諾喜表麻藥作用的研究，測(cè)量的角膜厚度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明倍諾喜表麻藥可增加角膜上皮的厚度，也可促使角膜上皮的松解，或許可縮短乙醇浸泡角膜上皮的時(shí)間。我們?cè)谘芯恐芯赏瑐€(gè)人滴入兔眼結(jié)膜囊，高度為2cm（瓶口距眼瞼水平面）。由于倍諾喜在24s就起效，可維持9~11min，為了使藥物充分起效，我們選擇滴藥后60s進(jìn)行研究。

我們對(duì)A超下角膜中央厚度與角膜上皮厚度與的相關(guān)分析（采用二元變量相關(guān)分析），二者呈正相關(guān)（r=0.579，P＝0.037）；因此A超下兔角膜中央厚度與角膜上皮厚度呈正相關(guān)，即角膜越厚，角膜上皮就越厚，這為我們以后研究提供可行性。

A超下角膜上皮厚度與共焦顯微鏡下角膜上皮厚度相關(guān)分析（采用二元變量相關(guān)分析），說明二者高度相關(guān)（r=0.593，P≤0.001）；本實(shí)驗(yàn)活體角膜上皮厚度是用A型超聲角膜測(cè)后儀測(cè)量的角膜厚度減去去角膜上皮的角膜厚度；最后我們也把對(duì)照組用同種方法去角膜上皮，使該相關(guān)研究的例數(shù)增加為40例。因此，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，共焦顯微鏡下兔的角膜上皮厚度與A超下角膜上皮厚度呈正相關(guān)，即A超下測(cè)量角膜上皮越厚，其共焦下測(cè)量角膜上皮也越厚。為以后進(jìn)一步研究角膜上皮與角膜厚度之間的關(guān)系提供相關(guān)依據(jù)。

盡管我們發(fā)現(xiàn)角膜上皮隨角膜厚度而變化，,且相關(guān)性強(qiáng),較真實(shí)地反映實(shí)際情況。但本研究是動(dòng)物實(shí)驗(yàn),動(dòng)物與人存在種屬差異,且我們采用的均是健康兔,死因一致,同時(shí)還控制了溫度和濕度等實(shí)驗(yàn)條件。這樣,和日常人所處的環(huán)境條件、個(gè)體差異、健康狀況、手術(shù)條件等影響均相似[10]。因此,必須了解各種影響因素對(duì)其作用規(guī)律,才能使角膜厚度與角膜上皮的相關(guān)性研究更加合理，準(zhǔn)確，為以后更廣泛進(jìn)一步地應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

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福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目基金資助(2006Y0013)。