侯澤江 徐 巍 郭 健 徐國興

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人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為RPE樣細(xì)胞的探討

侯澤江 徐 巍 郭 健 徐國興

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所

目的：探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外定向分化成視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）樣細(xì)胞所需的微環(huán)境。方法：采用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法分離純化BMSCs，第一階段將培養(yǎng)第3代的細(xì)胞以bFGF、EGF及BDNF三種因子首先進(jìn)行向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)細(xì)胞巢蛋白表達(dá)情況，當(dāng)巢蛋白陽性表達(dá)率達(dá)到最高時(shí)去除誘導(dǎo)因子，進(jìn)行第二階段與第三代人RPE細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)2w，兩階段誘導(dǎo)后均采用免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR方法檢測角蛋白及RPE65蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測方面，誘導(dǎo)第3d開始能檢測到巢蛋白表達(dá)，第12d陽性表達(dá)率達(dá)到最高，達(dá)（86.9±2.6)%，第一階段誘導(dǎo)后見角蛋白表達(dá)，未見RPE65蛋白表達(dá)，第二階段誘導(dǎo)后見角蛋白表達(dá)，陽性率為（60.8±3.1)%，見RPE65蛋白表達(dá)，陽性率為（25.7±3.8)%。RT-PCR檢測方面，兩階段角蛋白與RPE65蛋白結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果一致。結(jié)論：體外采用分階段誘導(dǎo)法，應(yīng)用因子bFGF、EGF、BDNF及與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)的微環(huán)境作用下能在體外誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)RPE細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白以及RPE65蛋白。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 共培養(yǎng)

視網(wǎng)膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）細(xì)胞組織學(xué)上來源于神經(jīng)外胚層，具有重要的生理功能，但是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無再生能力，因而，當(dāng)其功能障礙時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳性、變性性視網(wǎng)膜病變，如視網(wǎng)膜色素變性等，目前通過藥物和手術(shù)均不能阻止其進(jìn)展、惡化。通過視網(wǎng)膜干細(xì)胞途徑達(dá)到視網(wǎng)膜再生是一條希望之路，但是哺乳類動(dòng)物視網(wǎng)膜干細(xì)胞成年后則很少具有活性，因此，外源性視網(wǎng)膜細(xì)胞移植可能是一個(gè)有希望的途徑。

可直接應(yīng)用于移植的視網(wǎng)膜干細(xì)胞非常有限，組織工程學(xué)的興起為外源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞的產(chǎn)生帶來了新的希望，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是至今研究最值得關(guān)注的成體干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的多能成體干細(xì)胞，大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外不同的微環(huán)境對(duì)BMSCs具有不同的誘導(dǎo)分化效果。BMSCs不僅能向中胚層的成骨細(xì)胞等分化，而且能跨胚層分化，如向內(nèi)胚層的肝細(xì)胞樣細(xì)胞以及外胚層的神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞等分化。本實(shí)驗(yàn)探索誘導(dǎo)BMSCs向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向分化的微環(huán)境,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM-LG培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)； Taurine（Sigma,USA）；淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；小鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白8＆18單克隆抗體、小鼠抗人RPE65單克隆抗體（NeoMarkers，USA）；流式細(xì)胞術(shù)試劑小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE（Beckman-Coulter，USA）, RT-PCR試劑盒（Fermentas，USA），transwell雙層共培養(yǎng)系統(tǒng)（Corning，USA）。

1.2 方法

1.2.1骨髓的采集、BMSCs 的分離與培養(yǎng)

骨髓取自健康成年捐贈(zèng)者，實(shí)驗(yàn)符合國務(wù)院1994年頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》第33條原則。抽取骨髓約5mL，將骨髓用PBS稀釋后以1000rpm離心5min，洗滌2次，將下層血漿用等量DMEM-LG培養(yǎng)基重懸后采用淋巴細(xì)胞分離液（相對(duì)密度為1.077kg/L）密度梯度離心分離，輕輕吸取白色霧狀單核細(xì)胞層，置于離心管中再次用PBS洗滌2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基吹打分散后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后予以首次換液，以后每3d換液1次。

1.2.2 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞表面抗原的流式細(xì)胞儀檢測

倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及增殖情況，并拍照記錄。按照謝茂松等[1]對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)鑒定方法步驟進(jìn)行，第3代人BMSCs 90%融合時(shí)用胰蛋白酶消化，用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs CD34（造血干細(xì)胞表面抗原），CD44（基質(zhì)細(xì)胞表面抗原）及CD90（干細(xì)胞表面抗原）的表達(dá)情況。

1.2.3 RPE細(xì)胞的采集、分離與培養(yǎng)

RPE細(xì)胞取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科角膜移植術(shù)后的供體眼球，具體操作方法按照徐國興等[2]提出的步驟進(jìn)行，無菌條件下行眼杯消化法消化RPE層，將消化液中和后離心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后開始首次半量換液，以后每3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%時(shí)消化傳代。

1.2.4 RPE細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測鑒定

RPE65蛋白檢測：收集細(xì)胞爬片進(jìn)行RPE65蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血清封閉，加入小鼠抗人RPE65蛋白單克隆抗體（稀釋度為1：100），4℃過夜，滴加聚合物輔助劑及生物素化山羊抗小鼠IgG， DAB顯色及蘇木素復(fù)染，自來水洗滌后干燥，樹脂封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5誘導(dǎo)分化

實(shí)驗(yàn)分兩組：誘導(dǎo)組和對(duì)照組。誘導(dǎo)組分兩階段誘導(dǎo)：首先向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化，再進(jìn)一步與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)向RPE細(xì)胞專向誘導(dǎo)分化。取第3代人BMSCs按 5×104/mL密度接種六孔板中，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM-LG，每個(gè)六孔板中預(yù)先放蓋玻片進(jìn)行爬片，24h后將培養(yǎng)基更換為含20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF及 20ng/mLBDNF進(jìn)行第一階段誘導(dǎo)，在因子誘導(dǎo)的2d開始進(jìn)行巢蛋白的檢測，檢測到巢蛋白表達(dá)率最高時(shí)進(jìn)行第二階段誘導(dǎo)，采用transwell雙層非接觸共培養(yǎng)體系，將第一階段誘導(dǎo)的BMSCs接種于transwell下層并爬片，取第三代RPE細(xì)胞接種于transwell上層，進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)并觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)照組采用含10% FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加任何干預(yù)。

第二階段向RPE樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)后角蛋白及RPE65蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,角蛋白8＆18及RPE65蛋白抗體稀釋度均為1:100。

1.2.6共培養(yǎng)誘導(dǎo)前及共培養(yǎng)2w后采用RT-PCR方法檢測角蛋白及RPE65蛋白表達(dá)情況

第二階段誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)2w后，收集細(xì)胞，Trizol裂解細(xì)胞提總RNA，取1μlRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，然后以此cDNA為模板，以角蛋白引物序列：上游5'-GAGGCATCCAGAACGAGAAGG-3'下游5'-CGGGCATTG TCCACAGTATTTG-3'（擴(kuò)增片段長223bp），RPE65蛋白引物序列:上游：5'-TTCAACCTCTTCCATCACATCAAC-3'下游：5'-GATTCAAGCCAAGTCCATACGC-3'（擴(kuò)增片段長397bp），內(nèi)對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）引物序列：上游：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'下游：5'-TTTTAGG ATGGCAAGGGACTTC-3'（擴(kuò)增片段長度：556bp）（由南京金斯瑞生物公司設(shè)計(jì)并合成）擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 BMSC形態(tài)及鑒定結(jié)果

原代培養(yǎng)48h有部分細(xì)胞貼壁，少數(shù)形態(tài)呈桿狀，4~6d細(xì)胞呈桿狀或梭形，形成多個(gè)不同大小的細(xì)胞集落，7~10d呈放射狀向外擴(kuò)展，細(xì)胞呈梭形，并逐漸融合成漩渦狀單層細(xì)胞。傳代后細(xì)胞分布均勻，形態(tài)一致，長梭形，呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（見圖1）。

第3代人BMSCs表面抗原檢測顯示CD90表達(dá)陽性率CD90+/CD34-：96.3%，CD44表達(dá)陽性率CD44+/CD34-：94.2%，表明所獲得的細(xì)胞絕大部分為BMSCs。

2.2 RPE細(xì)胞鑒定：RPE65蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果

第三代RPE細(xì)胞呈梭形，融合時(shí)可呈多邊形，鏡下可見胞漿內(nèi)少量色素顆粒，隨著傳代的延續(xù)色素顆粒逐漸減少。

圖2 第三代RPE細(xì)胞融合（×100）

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測RPE細(xì)胞的RPE65蛋白表達(dá)情況（免疫細(xì)胞化學(xué)二步法，DAB染色，蘇木素復(fù)染，×100）

2.3 誘導(dǎo)第一階段誘導(dǎo)的BMSCs巢蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果

誘導(dǎo)第3d開始能檢測到巢蛋白表達(dá)，第12d陽性表達(dá)率達(dá)到最高，達(dá)（86.9±2.6)%。

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)BMSCs巢蛋白表達(dá)情況（免疫細(xì)胞化學(xué)二步法，DAB染色，蘇木素復(fù)染，×100）

2.4 誘導(dǎo)第一、二階段后細(xì)胞角蛋白及RPE65蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果

第一階段誘導(dǎo)后可檢測到角蛋白表達(dá)，但未見RPE65蛋白表達(dá)；第二階段誘導(dǎo)后檢測到角蛋白陽性率為（60.8±3.1)%，RPE65蛋白表達(dá)陽性率為（25.7±3.8)%；

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)BMSCs角蛋白表達(dá)情況（免疫細(xì)胞化學(xué)二步法，DAB染色，蘇木素復(fù)染，×100）

圖6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)BMSCs后RPE65蛋白表達(dá)情況（免疫細(xì)胞化學(xué)二步法，DAB染色，蘇木素復(fù)染，×100）

2.5 誘導(dǎo)第一、二階段角蛋白及RPE65蛋白的RT-PCR檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組第一階段誘導(dǎo)后RT-PCR檢測角蛋白及RPE65蛋白，發(fā)現(xiàn)有角蛋白表達(dá)，未見明顯RPE65蛋白表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組第二階段誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)角蛋白及RPE65蛋白均有表達(dá)；對(duì)照組未見角蛋白及RPE65蛋白表達(dá)。

圖7 兩階段誘導(dǎo)角蛋白的RT-PCR 結(jié)果

圖8 兩階段誘導(dǎo)RPE65蛋白的RT-PCR 結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用分階段誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)外胚層來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞方向分化。干細(xì)胞在體內(nèi)分化與微環(huán)境密切相關(guān)，不同的發(fā)育階段干細(xì)胞所處的微環(huán)境不同將會(huì)影響干細(xì)胞發(fā)生不同的分化，干細(xì)胞進(jìn)入新的微環(huán)境后,對(duì)新的微環(huán)境的調(diào)節(jié)信號(hào)做出反應(yīng)，分化成與新的生長環(huán)境相適應(yīng)的細(xì)胞。我們采用分階段誘導(dǎo)是在細(xì)胞分化的不同階段提供合適的微環(huán)境以期向特定細(xì)胞分化。第一階段采用神經(jīng)細(xì)胞生長分化所必須的生長因子誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)前體細(xì)胞分化，第二階段將分化成的神經(jīng)前體細(xì)胞與RPE細(xì)胞供培養(yǎng)，利用RPE細(xì)胞所分泌的相關(guān)物質(zhì)來提供一個(gè)微環(huán)境，促使誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞向RPE樣細(xì)胞分化。

有實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞表面存在PDGF、FGF和EGF受體等。本實(shí)驗(yàn)首先使用bFGF、EGF及BDNF三種因子進(jìn)行誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化。這些因子具有以下的生物學(xué)功能：bFGF具有促有絲分裂功能，在神經(jīng)元發(fā)生、分化和功能方面起著重要作用，在體外bFGF能提高視網(wǎng)膜表達(dá)視蛋白的水平，體內(nèi)有神經(jīng)視網(wǎng)膜保護(hù)作用。BDNF能延緩神經(jīng)元的變性和自然死亡，對(duì)神經(jīng)元的存活和生長具有重要作用，有很強(qiáng)的刺激和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長、分化的功能；不僅能保護(hù)神經(jīng)元的功能，而且能促進(jìn)光損傷的視網(wǎng)膜修復(fù)；BDNF能明顯促進(jìn)光感受器細(xì)胞生存；在發(fā)育中的RPE細(xì)胞中有BDNF表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGF存在于視網(wǎng)膜，可能與胚胎發(fā)育期和生后的光感受器細(xì)胞的誘導(dǎo)分化有關(guān)，它是視網(wǎng)膜神經(jīng)元有效的分化因子。

RPE細(xì)胞能分泌多種生長因子,這些因子是維持視網(wǎng)膜完整結(jié)構(gòu)所必須的，RPE維持光感受器細(xì)胞的存活，RPE能分泌FGF（FGF-1, FGF-2, FGF-5），IGF-1,PEDF等。PEDF有神經(jīng)保護(hù)和為抗血管生成功能，提供環(huán)境保護(hù)，健康眼RPE能分泌PEDF維持視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)，并支持光感受器細(xì)胞和神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的生長[3]。RPE細(xì)胞已知的能分泌以上多種因子，還有分泌一些其他未知的營養(yǎng)成分，這些對(duì)于RPE細(xì)胞的生長是必需的，因此本實(shí)驗(yàn)將誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)前體細(xì)胞再與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)，利用RPE細(xì)胞分泌的各種因子為神經(jīng)前體細(xì)胞提供一個(gè)微環(huán)境，以促進(jìn)其向RPE樣細(xì)胞方向分化。

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞角蛋白8＆18(CK8＆18)與RPE65蛋白鑒定誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞。細(xì)胞角蛋白是細(xì)胞骨架蛋白的一種，見于所有的上皮細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白包括多個(gè)亞型，不同的上皮細(xì)胞表達(dá)不同亞型的細(xì)胞角蛋白。RPE細(xì)胞表達(dá)分子量為45KD的CK18和分子量52KD的CK8。而在視網(wǎng)膜組織，RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的上皮細(xì)胞，其它非上皮細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞角蛋白表面標(biāo)志。RPE65 基因定位于1p31,編碼視網(wǎng)膜色素上皮特異蛋白, RPE65蛋白是RPE細(xì)胞特異性蛋白，故而在該組織中表明就是RPE細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)第一階段檢測角蛋白即有表達(dá)，但未見RPE65蛋白表達(dá)；第二階段誘導(dǎo)分化后檢測細(xì)胞的角蛋白8＆18與RPE65蛋白，均有表達(dá)，表明所誘導(dǎo)的部分細(xì)胞具有合成角蛋白8＆18與RPE65蛋白的特征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境下可以誘導(dǎo)BMSCs分化為表達(dá)角蛋白及RPE65蛋白的細(xì)胞，但體外的誘導(dǎo)與體內(nèi)的微環(huán)境有著很大的差別，體外誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否具有RPE細(xì)胞的生理功能如吞噬功能，有序排列，形成緊密連接等仍不明確，這些問題均需要更加深入的研究。

[1] 謝茂松,徐國興,李瓊等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的比較[J].國際眼科雜志,2007,7（5）:1285-1287.

[2] 徐國興,楊娟,孫堂勝等.體外原代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[J].國際眼科雜志,2004,4（1）:12-15.

[3] Barnstable CJ, Tombran-Tink J. Neuroprotective and antian-giogenic actions of PEDF in the eye: molecular targets and therapeutic potential, Prog. Retin. Eye Res, 2004, 23:561–577.

1.福建省省重點(diǎn)科研課題（基金編號(hào)：2008Y0040）。 2.國家衛(wèi)生部科研基金課題（基金編號(hào)：WKJ2008-2-61）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。