田野 李旺 劉順明 劉鵬 楊秀麗（山東輕工業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)南，50353；山東壽光濰坊科技學(xué)院，壽光，6700）

纖維原料酶水解的研究進(jìn)展

田野1李旺2劉順明1劉鵬1楊秀麗1
（1山東輕工業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)南，250353；2山東壽光濰坊科技學(xué)院，壽光，262700）

木質(zhì)纖維原料酶水解是利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精的關(guān)鍵步驟之一。對(duì)纖維素酶及其水解木質(zhì)纖維原料作用機(jī)制、纖維素酶的生產(chǎn)、木質(zhì)纖維原料酶水解的影響因素和木質(zhì)纖維原料酶水解動(dòng)力學(xué)作了全面綜述,并對(duì)提高木質(zhì)纖維原料酶水解效率和降低水解成本的途徑進(jìn)行了討論。

木質(zhì)纖維原料 纖維素酶 酶水解

以木質(zhì)纖維為原料生產(chǎn)燃料酒精是解決人類所面臨能源和環(huán)境問題,保持社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的一條有效途經(jīng)。木質(zhì)纖維原料水解是利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精的關(guān)鍵步驟之一[1]。人們對(duì)木質(zhì)纖維原料水解已進(jìn)行了大量的研究工作,早在1819年人們便開始采用濃酸對(duì)木質(zhì)纖維原料水解的研究[2],1888年開始采用稀酸對(duì)木質(zhì)纖維原料水解的研究[3],并于1898年建成第一套木質(zhì)纖維原料酸水解的工業(yè)化裝置[2]。在20世紀(jì)30～40年代人們對(duì)木質(zhì)纖維酸水解然后發(fā)酵生產(chǎn)酒精進(jìn)行了大量的研究工作,在木質(zhì)纖維酸水解工藝方面進(jìn)行了不少改進(jìn),開發(fā)成功高溫稀酸木質(zhì)纖維酸水解的Scholler&Madison工藝,以木質(zhì)纖維為原料生產(chǎn)酒精得到了較大的發(fā)展[2]。但由于強(qiáng)酸對(duì)設(shè)備的腐蝕,對(duì)環(huán)境所造成污染及強(qiáng)酸回收利用等方面得不到好的解決,因此,以后木質(zhì)纖維原料酸水解一直沒有大的發(fā)展。而木質(zhì)纖維的酶水解具有反應(yīng)條件溫和,對(duì)設(shè)備基本無腐蝕,環(huán)境友好,水解產(chǎn)物對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)酒精抑制作用較弱,而得到較快的發(fā)展。木質(zhì)纖維的酶水解在整個(gè)由木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精成本中占60%左右 ,控制木質(zhì)纖維的酶水解的成本,在由木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精工業(yè)化過程中,起著非常重要的作用。本文作者對(duì)纖維素酶及其水解木質(zhì)纖維原料作用機(jī)制、纖維素酶的生產(chǎn)、木質(zhì)纖維原料酶水解的影響因素、木質(zhì)纖維原料酶水解動(dòng)力學(xué)及提高木質(zhì)纖維酶水解效率和降低水解成本的途徑加以分析。

1 纖維素酶及其水解木質(zhì)纖維原料作用機(jī)制

纖維素酶是降解纖維素原料生成葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單種酶,而是起協(xié)同作用的多組分酶系[3]。自1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來,人們對(duì)纖維素酶的組成、結(jié)構(gòu)和水解作用機(jī)制已做過大量研究。對(duì)于一個(gè)完整的纖維素酶系而言,它至少包括3類性質(zhì)不同的酶。

1.1 C1酶

C1酶是纖維素酶系中的重要組分,它在天然纖維素的降解過程中起主導(dǎo)作用。但是對(duì)它在纖維素水解過程中的作用有不同的看法。Reese等認(rèn)為C1酶的作用是將結(jié)晶性纖維素變成非結(jié)晶性纖維素,而Wood和Mccrae則認(rèn)為C1酶實(shí)際上是一種水解酶,其作用是將結(jié)晶性纖維素水解為纖維二糖。

1.2 Cx酶

Cx酶又稱之為β-1,4-葡聚糖酶,是一種水解酶,它不能作用結(jié)晶性纖維素,主要作用是水解非結(jié)晶性纖維素。它有兩種不同的類型:外切β-1,4-葡聚糖酶和內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶。外切β-1,4-葡聚糖酶能從纖維素鏈的非還原性末端一個(gè)一個(gè)地依次切下葡萄糖單位,產(chǎn)物是葡萄糖,其專一性比較強(qiáng)。同時(shí)它對(duì)纖維寡糖的親合力強(qiáng),能迅速水解內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶作用纖維素產(chǎn)生的纖維寡糖為葡萄糖。內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶以隨機(jī)形式水解非結(jié)晶性纖維素,它作用于較長的纖維素鏈,對(duì)末端的敏感性小,水解主要產(chǎn)物是纖維糊精,纖維三糖和纖維二糖。

1.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶又稱之為纖維二糖酶,其作用是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶水解非結(jié)晶性纖維素得到的產(chǎn)物是纖維糊精,纖維三糖和纖維二糖水解為葡萄糖。該酶的專一性比較差。對(duì)于同一類性質(zhì)的酶,其分子結(jié)構(gòu)并不相同。但一般來講,纖維素酶都應(yīng)包含結(jié)合區(qū)和催化區(qū)兩部分。由不同的微生物所合成的纖維素酶的組成不同,結(jié)構(gòu)不同,對(duì)于纖維素具不同的分解能力。目前,對(duì)于纖維素酶水解纖維素的作用機(jī)制有多種假說,大家普遍認(rèn)可的是Reese等提出的C1-Cx假說,如圖1所示。但對(duì)于C1-Cx假說來說,存在兩個(gè)方面的問題:一個(gè)是到目前為止,沒有分離出將結(jié)晶性纖維素變成非結(jié)晶性纖維素的C1酶,另一個(gè)是C1酶如何將結(jié)晶性纖維素變成非結(jié)晶性纖維素。對(duì)于纖維素酶水解纖維素的作用機(jī)制另一普遍認(rèn)可的事實(shí)是構(gòu)成纖維素酶的各組分間存在協(xié)同作用[4]。

圖1 纖維素酶水解纖維素的C1-Cx作用機(jī)制模型

2 纖維素酶的生產(chǎn)

自然界很多微生物具有產(chǎn)生纖維素酶降解木質(zhì)纖維的能力,包括真菌、細(xì)菌及部分放線菌。文獻(xiàn)報(bào)道的真菌有:Trichoderm a reesei,Trichoderm akoningii,Trichoderm a lignorum,Aspergillus n iger,Asperg illus f lavus,Aspergillus oryzae,S ch izophy llumcomm une,Penicillium citrinum,Penicillium nota 2tum,Sclerotium rolfsii等[14-15,17,22-23]。 文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)菌有:Cellulom onas f im i,Clostridium longispo2 rum,B acillus lautus,Therm om onospora fusca,Clos2tridium therm ocellum,B acteroides cellulosolvens等 。盡管文獻(xiàn)報(bào)道有超過200種微生物具有產(chǎn)生纖維素酶的能力,但研究最多并用于工業(yè)生產(chǎn)的主要是Trichoderm a屬的真菌,特別是Trichoderm a reesei。工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶可以采用深層液體發(fā)酵,也可采用固體發(fā)酵,目前工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶仍以固體發(fā)酵為主[5]。盡管固體發(fā)酵設(shè)備簡單,投資少,但發(fā)酵水平不穩(wěn)定,生產(chǎn)效率低,易染雜菌,工人勞動(dòng)強(qiáng)度大,不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。深層液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶是以后的發(fā)展方向 。目前,纖維素酶水解木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精成本高,來自于纖維素酶生產(chǎn)主要原因表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一方面是纖維素酶的水解效率低(相比于淀粉酶),這在很大程度上是由于纖維素酶是一個(gè)起協(xié)同作用的多組分酶系,各個(gè)組分之間配合不協(xié)調(diào)所致。目前應(yīng)用最多的李氏木酶就存在這個(gè)問題,解決這個(gè)問題方法之一就是通過基因工程的方法將黑曲酶的纖維二糖酶基因轉(zhuǎn)入李氏木酶,并得到表達(dá) 。另一方面是纖維素酶的生產(chǎn)成本高,這可以通過改良菌種,優(yōu)化培養(yǎng)條件和降低培養(yǎng)基成本而逐步得到解決。另外一個(gè)令人們很感興趣可能會(huì)大幅降低纖維素酶生產(chǎn)成本的方法是通過基因工程的方法將纖維素酶基因轉(zhuǎn)入植物并得到高效表達(dá)[6]。Sun將源自A.celluloly ticus的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶轉(zhuǎn)入一種稱為浮萍的植物并得到表達(dá),內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶占浮萍中可溶性蛋白的0.27%。Ziegelhoffer等將源自Therm om onospora fusca的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶與纖維二糖酶轉(zhuǎn)入煙草,內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶與纖維二糖酶分別占煙草可溶性蛋白的0.1%和0.02%。Hooker等將源自A.cellulolyticus的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶轉(zhuǎn)入煙草和土豆,內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶分別占煙草和土豆可溶性蛋白的1.35%和2.6%。Ziegler等將源自A.cellulolyticus的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶轉(zhuǎn)入一種稱為A.thaliana的植物,內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶占其葉子的可溶性蛋白的26%。由此可見,轉(zhuǎn)基因植物確實(shí)可能成為廉價(jià)生產(chǎn)纖維素酶的一種方法。

3 木質(zhì)纖維原料酶水解的影響因素

影響木質(zhì)纖維原料酶水解的因素主要包括:底物、纖維素酶和水解條件。底物(經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維原料)通過兩個(gè)方面影響其酶水解速率和可發(fā)酵糖的得率,一方面是底物的性質(zhì),它包括預(yù)處理后的木質(zhì)纖維原料的可及度、纖維素的結(jié)晶度、木質(zhì)素和半纖維素的含量及其與纖維素的結(jié)合方式[7],同時(shí)也包括預(yù)處理后的木質(zhì)纖維原料是否含有酶水解的抑制物,抑制物的種類和數(shù)量,這就說明選擇合適的預(yù)處理方法對(duì)木質(zhì)纖維原料酶水解至關(guān)重要,如Vlasenko曾對(duì)采用不同的預(yù)處理方法對(duì)稻草水解進(jìn)行過對(duì)比研究。另一方面是底物的濃度,底物濃度過高對(duì)木質(zhì)纖維原料酶水解有抑制作用,會(huì)使木質(zhì)纖維原料酶水解速率變慢,可發(fā)酵糖的得率降低,但如果底物濃度過低,木質(zhì)纖維原料酶水解速率慢,所得可發(fā)酵糖濃度低而無工業(yè)應(yīng)用價(jià)值,因此木質(zhì)纖維原料酶水解有一個(gè)最佳底物濃度。纖維素酶是影響木質(zhì)纖維原料酶水解成本與水解效率的另一關(guān)鍵因素,由于不同的微生物會(huì)產(chǎn)生不同酶系的纖維素酶,對(duì)不同的木質(zhì)纖維原料有不同的水解能力,因此根據(jù)底物的性質(zhì)選用合適的纖維素酶至關(guān)重要,在必要時(shí)需采用來源于不同微生物纖維素酶復(fù)配而成的復(fù)合酶制劑;另外酶的用量對(duì)木質(zhì)纖維原料酶水解的成本與經(jīng)濟(jì)的可行性有決定性的作用,因此合適的酶濃度是木質(zhì)纖維原料酶水解所必需的。木質(zhì)纖維酶水解條件包括酶水解溫度、pH值、底物濃度、酶用量和水解時(shí)間,它們?cè)诿杆膺^程中的重要性很早就受到人們的重視,人們已通過多種方法對(duì)木質(zhì)纖維酶的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化[8]。

4 木質(zhì)纖維原料酶水解動(dòng)力

木質(zhì)纖維原料酶水解的動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于弄清木質(zhì)纖維原料酶水解的過程機(jī)制、工程放大和過程控制都具有重要意義,因此人們對(duì)于木質(zhì)纖維原料酶水解的動(dòng)力學(xué)已進(jìn)行了大量的研究工作[9]。但是由于木質(zhì)纖維原料酶水解過程的復(fù)雜性,包括底物的組成與結(jié)構(gòu)的多樣性、纖維素酶來源及成分的多樣性和在酶水解過程中底物的反應(yīng)能力的變化及纖維素酶活性的變化,使得各個(gè)研究者所得出酶水解的動(dòng)力學(xué)表達(dá)式及模型參數(shù)值差異較大,對(duì)于描述木質(zhì)纖維原料酶水解過程不具有普遍意義。不過,在木質(zhì)纖維原料酶水解的動(dòng)力學(xué)研究方面下面兩點(diǎn)認(rèn)識(shí)是一致的。一是木質(zhì)纖維原料酶水解是一個(gè)非均相反應(yīng),纖維素酶首先要擴(kuò)散到底物的表面,在底物的表面被吸附,然后反應(yīng)將纖維素水解為可發(fā)糖,纖維素酶在經(jīng)過解吸和擴(kuò)散進(jìn)入溶液主體,生成的可發(fā)酵糖也經(jīng)過擴(kuò)散進(jìn)入溶液主體。另外一點(diǎn)是木質(zhì)纖維原料酶水解會(huì)受到底物和水解產(chǎn)物 (纖維二糖和葡萄糖)的抑制,在同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精時(shí)還會(huì)受到發(fā)酵產(chǎn)物酒精的抑制,如圖2所示:

圖2 木質(zhì)纖維同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精的調(diào)控機(jī)制示意圖

結(jié)論

提高木質(zhì)纖維原料酶水解效率與降低水解成本一直是人們研究由木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料酒精的重點(diǎn)。人們對(duì)此已進(jìn)行過大量的研究,主要有以下幾種措施:

1)選高產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)菌株,或是采用基因工程方法構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶基因工程菌,選取合適的發(fā)酵方法與后提取工藝,以降低纖維素酶的生產(chǎn)成本[10]。同時(shí),利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)纖維素酶也可能是大幅降低纖維素酶的生產(chǎn)成本的一種方法。

2)對(duì)纖維素酶生產(chǎn)菌株采用基因工程方法進(jìn)行改良,使其產(chǎn)生的纖維素酶各個(gè)組分配合更加協(xié)調(diào),構(gòu)成一個(gè)高效的纖維素酶系,以提高木質(zhì)纖維原料的酶水解效率[11]。

3)在對(duì)木質(zhì)纖維原料進(jìn)行預(yù)處理的時(shí)侯,應(yīng)最大限度地增加木質(zhì)纖維原料的可及度、降低其纖維素的結(jié)晶度、除去其中的木質(zhì)素和半纖維素 ,但應(yīng)盡量避免木質(zhì)纖維原料酶解的抑制物的生成[12]。

4)在木質(zhì)纖維原料酶水解過程中加入非離子表面活性劑,減少纖維素酶與纖維素之間的不可逆結(jié)合和纖維素酶與木質(zhì)素之間的非選擇性吸附,從而提高木質(zhì)纖維原料的酶水解效率。

5)在酶水解過程中采用酶復(fù)合制劑,使各種不同性質(zhì)的酶更好地協(xié)同作用,減小纖維二糖、產(chǎn)物還原糖和半纖維素水解產(chǎn)物對(duì)酶水解過程抑制作用,如在Trichoderm a reesei所產(chǎn)生的纖維素酶中加入纖維二糖酶就能有效地加快木質(zhì)纖維原料的酶水解[13]。

6)對(duì)纖維素酶進(jìn)行固定化,以便纖維素酶的重復(fù)使用,從而降低木質(zhì)纖維原料的酶水解的成本。另有報(bào)道通過膜分離的方法可以有效的回收纖維素酶,降低木質(zhì)纖維原料的酶水解的成本[14]。

7)為了有效地消除產(chǎn)物抑制,將水解可發(fā)酵糖從酶水解系統(tǒng)通過超濾移出,或是采用同步糖化發(fā)酵及時(shí)將生成的可發(fā)酵糖消耗掉[15]。

8)用同步產(chǎn)酶與糖化工藝,將纖維素酶的合成與木質(zhì)纖維原料的酶水解耦合在同一裝置內(nèi)進(jìn)行,這樣即可以減化工藝,同時(shí)又可以減少設(shè)備投資[16]。

[1]朱圣東,吳元欣,喻子牛,等.微波預(yù)處理稻草糖化工藝研究 [J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2005,25 (1):112-114

[2]SCHERRARD E C,KRESSMAN F W.Review of p rocesses inthe United States p rior to World WarⅡ[J].Ind Eng Chem,1945,37(1):5-8

[3]張樹政,倫世儀,朱慶斐,等.酶制劑工業(yè)(下冊(cè)).北京:科學(xué)出版社,1998:595-624

[4]REESE E,SIU T,LEV INSON H S.The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to themechanism of cellulose hydrolysis[J].J Bacteriol,1950,59(4):485-497

[5]WOOD TM,MCCRAE S L.Cellulase from Fusarium solsni:purification and p roperties of the C1 component[J].Carbhydr Res,1977(57):117-133

[6]HERBERSK,SONNEWALD U.Xylaneses.//Owen M R L,Pen J(eds),Transgenic p lants:a p roduction system for industrial and pharmaceutical p roteins.New York:John Wiley&Sons,1996:191-200

[7]MCM ILLAN J D.Pretreatment of lignocellulosic biomass.//HimmelM E,Baker J O,Overend R P(Eds.),Enzymatic conversion of biomass for fuel p roduction.Washington DC:American Chemical Society,1994:292-324

[8]李穩(wěn)宏,吳大雄,李寶璋.麥秸纖維素酶解法制糖研究[J].化學(xué)工程,1998,26(1):54-61

[9]LEE Y H,FAN L T.Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of insoluble cellulose:analysis of the initial rates[J].Biotechnol Bioeng,1982,24(11):2383-2406

[10]WOOD TM,MCCRAE S L.Cellulase from Fusarium solsni:purification and p roperties of the C1 component[J].Carbhydr Res,1977(57):117-133

[11]HERBERS K,SONNEWALD U.Xylaneses.//Owen M R L,Pen J(eds),Transgenic p lants:a p roduction system for industrial and pharmaceutical p roteins.New York:John Wiley&Sons,1996:191-200

[12]KR ISHNAN M S.Process development of fuel ethanol p roduction from lignocellulosic sugars using genetically engineered yeast.Purdue University,1996

[13]GHOSE T K,B ISAR IA V S.Studies on mechanism of enzymatic hydrolysis of cellulosic substrates [J].Biotechnol Bioeng,1979,21 (1):131-146

[14]鄭成,松本干治.蔗渣酶法水解與膜分離研究[J].化學(xué)工業(yè)與工程,1996,13(4):30-36

[15]杜秉海,曲音波,高培基.纖維廢渣固態(tài)酒精發(fā)酵及纖維素-淀粉共發(fā)酵的研究 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),1995,21(5):15-20

[16]夏黎明,代淑梅.應(yīng)用固定化李氏木酶糖化玉米桿纖維素的研究[J].微生物學(xué)報(bào),1998,38(2):44-49

2010－8－11

田野（1982.10.2） .

山東輕工業(yè)學(xué)院在讀研究生

研究方向:制漿造紙綠色化學(xué)與技術(shù)

E-mail:tianye861080@163.com

電話:15254117641

通訊地址:山東濟(jì)南西部長清大學(xué)城,山東輕工業(yè)學(xué)院制漿造紙08級(jí)研究生

環(huán)境保護(hù)