韓 冰 張曉紅 (吉林大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

平陽(yáng)霉素目前主要應(yīng)用在治療老年人易發(fā)的惡性腫瘤中且療效顯著〔1,2〕。一些良性腫瘤和良性病變,如淋巴管瘤、血管瘤、眼科翼狀胬肉、皮膚尖銳濕疣和白癜風(fēng)、鼻息肉等在應(yīng)用平陽(yáng)霉素治療時(shí)均見(jiàn)到令人滿(mǎn)意的療效〔3〕。平陽(yáng)霉素的應(yīng)用由于受限于半衰期短,給藥方式局限性大,在中國(guó)的臨床應(yīng)用主要圍繞在原位給藥,使得平陽(yáng)霉素的抗腫瘤特性沒(méi)有得到很好的應(yīng)用。治療時(shí)需連續(xù)注射給藥給患者增添了麻煩,尤其是老年患者更加難以承受連續(xù)注射帶來(lái)的痛苦。聚乳酸羥基乙酸(PLGA)共聚物是一種藥物制劑制備中常用的藥用輔料,該材料具有緩釋釋放降解的性質(zhì),目前已被美國(guó) FDA批準(zhǔn)用于各種藥物制劑的制備和作為醫(yī)用材料〔4〕。本研究擬運(yùn)用 PLGA包裹平陽(yáng)霉素制備成 PLGA微球制劑,以有效地解決平陽(yáng)霉素生物半衰期短的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥品、試劑與儀器 2歲齡比格犬 6只,雌雄各半,體重 12.5～14 kg,吉林天藥科技有限公司動(dòng)物中心提供。平陽(yáng)霉素注射劑 (中國(guó)哈爾濱博萊制藥有限公司),PLGA(美國(guó)lakeshore公司),PVA(美國(guó) Sigma公司),二氯甲烷 (中國(guó)天津試劑廠),API4000質(zhì)譜儀 (美國(guó) Applied Biosystem公司),KQ-300DV臺(tái)式數(shù)控超聲儀 (上海精密儀器儀表公司)。

1.2 平陽(yáng)霉素 PLGA微球的制備 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的平陽(yáng)霉素水溶液加至溶有 PLGA的二氯甲烷溶液的初乳反應(yīng)器中,運(yùn)用均質(zhì)器在初乳反應(yīng)器中高速攪拌制備油包水的初乳,再將該初乳緩緩注入聚乙烯醇 (PVA)水溶液中。在自制的復(fù)乳攪拌反應(yīng)器中,600 r/min攪拌形成水包油包水的復(fù)乳,然后300 r/min攪拌復(fù)乳,其間保持反應(yīng)器內(nèi)的氣體流通,攪拌 3.5 h后即得到固化的平陽(yáng)霉素 PLGA微球。將該微球用蒸餾水反復(fù)沖洗,去除掉雜質(zhì),用冷凍干燥法干燥后得到平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑〔5〕。

1.3 平陽(yáng)霉素 PLGA微球包封率及形態(tài)學(xué)測(cè)定 精密稱(chēng)取平陽(yáng)霉素 PLGA微球 100 mg放入 50 ml容量瓶中,加適量乙腈溶液,待微球全部溶解后,用水定容并超聲。取上清液用高效液相法測(cè)定上清液平陽(yáng)霉素濃度,折算包封率。將凍干后的平陽(yáng)霉素 PLGA微球進(jìn)行粒徑檢測(cè)并通過(guò)電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 平陽(yáng)霉素 PLGA微球體外釋放的測(cè)定 精密稱(chēng)取制備好的平陽(yáng)霉素微球 40 mg,置于含 25 ml體外釋放液的特制試管中并用封口膜密封,放置到 37℃的恒溫?fù)u床中 75 r/min振蕩,分別于 4 h,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24,28 d取出 20 ml上清液,并將上清液離心后取上清液,等待液相檢測(cè),同時(shí)補(bǔ)充

20 ml體外釋放液。用高效液相法測(cè)定每次時(shí)間點(diǎn)取出的上清液中平陽(yáng)霉素的含量〔6〕,以此測(cè)定 28 d的累積釋放百分率。將平陽(yáng)霉素微球按照此體外實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)操作 6次,做平陽(yáng)霉素微球體外平均的釋放曲線。

1.5 平陽(yáng)霉素 PLGA微球的體內(nèi)釋放 將制備好的平陽(yáng)霉素PLGA微球以臀部肌肉深部注射方式注射到一組比格犬體內(nèi),雌雄各半共 6只比格犬。在 4 h,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24,28 d時(shí)采取血樣 3 ml,檢測(cè)血中平陽(yáng)霉素的濃度。做血藥濃度釋放曲線圖,分析平陽(yáng)霉素 PLGA微球體內(nèi)釋放情況。

2 結(jié) 果

2.1 平陽(yáng)霉素 PLGA微球包封率及形態(tài)學(xué) 平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑呈白色粉末狀,無(wú)塌陷或萎縮現(xiàn)象,球形致密圓整。平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑平均粒徑為 3.7μm,其中微球粒徑為300 nm～10μm,該微球制劑包封率可達(dá) 65%以上。

2.2 平陽(yáng)霉素 PLGA微球體外釋放結(jié)果 平陽(yáng)霉素可以在28 d內(nèi)從微球中完全釋放出去,體外釋放曲線顯示 10 d內(nèi)平均累積釋放率超過(guò) 45%(圖1),20 d內(nèi)的平均累積釋放率超過(guò)80%。根據(jù)平陽(yáng)霉素普通制劑用藥的用法用量,適宜每 20 d注射一次,而微球釋放的前 20 d累積釋放率較高,釋放了超過(guò)總藥量的 87%,體外釋藥曲線平穩(wěn),適于進(jìn)行體內(nèi)釋放試驗(yàn)。

2.3 平陽(yáng)霉素 PLGA微球體內(nèi)釋放結(jié)果 平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑可在比格犬體內(nèi)穩(wěn)定釋放。微球制劑中的平陽(yáng)霉素可以在 24 d內(nèi)從微球中完全釋放出去。平陽(yáng)霉素 PLGA微球的體內(nèi)釋放曲線顯示 10 d內(nèi)的平均累積釋放率超過(guò) 60%,20 d內(nèi)的平均累積釋放率超過(guò) 97%,該平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑符合每 20 d作為一個(gè)療程并僅注射一次的用藥需要。

3 討 論

平陽(yáng)霉素已在臨床應(yīng)用于治療唇癌、舌癌、眼癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、外陰癌、陰莖癌等癌癥〔1,2〕。平陽(yáng)霉素可以依靠疏水作用及氫鍵價(jià)鍵力與腫瘤細(xì)胞的雙鏈DNA中 5～6個(gè)多聚鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶堿基對(duì)結(jié)合,并使之?dāng)噫溓艺T發(fā)染色體畸變,影響癌細(xì)胞代謝功能,促進(jìn)癌細(xì)胞變性壞死〔7〕。平陽(yáng)霉素的缺點(diǎn)是半衰期短,臨床應(yīng)用時(shí)需一次給藥4～20 mg,可靜脈注射、動(dòng)脈注射、肌肉注射和瘤內(nèi)注射,每日給藥一次或每隔日給藥一次,最少需連續(xù)應(yīng)用 20 d以上。平陽(yáng)霉素是否原位給藥,或者說(shuō)接受平陽(yáng)霉素的給藥部位和靶器官的遠(yuǎn)近并不能完全決定其是否能大量親和在腫瘤細(xì)胞的 DNA上,而腫瘤細(xì)胞不斷擴(kuò)增,形成大量的半裸 DNA,使血液循環(huán)中的平陽(yáng)霉素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后更易接近并切斷 DNA。所以制備成微球形式的肌肉注射平陽(yáng)霉素微球制劑并不會(huì)比原位給藥的藥效差。從平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑在比格犬體內(nèi)的釋放測(cè)試結(jié)果來(lái)看,在 20 d內(nèi)平陽(yáng)霉素持續(xù)釋放,注射一針次基本可以保證藥效持續(xù) 20 d。平陽(yáng)霉素微球肌肉注射和瘤內(nèi)注射的差別僅僅是在局部血藥濃度的差別上。瘤內(nèi)注射或是原位給藥時(shí),由于局部血液循環(huán)受阻后,可使藥物更長(zhǎng)時(shí)間地滯留于局部組織,但是這種差別也僅僅持續(xù)很短的時(shí)間。若不運(yùn)用其他外界方法去協(xié)同維持,局部血藥濃度無(wú)法維持在一個(gè)較高水平,而這種短時(shí)間不會(huì)使應(yīng)用平陽(yáng)霉素的治療較肌肉注射法產(chǎn)生更好的實(shí)質(zhì)性好處,與體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)相比體內(nèi)載藥微球的緩釋作用更明顯,可見(jiàn)血藥濃度在體內(nèi)的維持時(shí)間足夠長(zhǎng),對(duì)腫瘤細(xì)胞可以起到足夠的殺傷作用。平陽(yáng)霉素 PLGA微球長(zhǎng)效制劑較平陽(yáng)霉素普通制劑具有更好的生物依從性和更長(zhǎng)的生物半衰期。該平陽(yáng)霉素長(zhǎng)效肌肉注射制劑的成功研制可為解決短效制劑長(zhǎng)期頻繁應(yīng)用提供更多的解決辦法。

圖1 平陽(yáng)霉素 PLGA微球制劑 28 d的體外和體內(nèi)平均藥釋曲線

1 Wang CG,Liu J,GaoQH.Preparation and characterization of Pingyangmycin-loaded bovine serum albumin microspheres for embolization therapy〔J〕.Int J Phar mac,2007;336(2)：361-6.

2 林 勇,蘇全勝,劉 暢 .p53基因聯(lián)合化療治療復(fù)發(fā)鼻咽癌 1例報(bào)告〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2006;26(1)：126-7.

3 王文錦 .平陽(yáng)霉素作用機(jī)制和臨床應(yīng)用〔J〕.中國(guó)腫瘤臨床,1992;19(3)：223-4.

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5 韓 冰,高 揚(yáng),裴 瑾 .阿柔比星緩釋制劑的制備工藝研究〔J〕.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2008;8(7)：1115-6.

6 Gao ZB,Ding PT,Zhang L,et al.Study of a Pingyangmycin delivery system：Zein/Zein– SA IB in situ gels〔J〕.Int J Phar mac,2007;328(1)：57-64.

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