康照昌 李玉榮 敖明章 (湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理學(xué)院,湖北 孝感 432000)

隨著現(xiàn)代航天航海事業(yè)的發(fā)展,世界各國都在開展運動病的研究工作,對防治運動病的研究已經(jīng)取得了一定的成果,但尚無公認(rèn)的療效確切、副作用少的治療措施。尋找更為有效、更安全的抗運動病方法日益引起國內(nèi)外重視。目前的抗運動病藥物主要包括抗膽堿、抗組胺類及擬交感胺類等,雖有一定的抗運動病作用,但多有中樞抑制作用,限制了其臨床使用。而我國自古就應(yīng)用中草藥生姜抗眩暈病,生姜有確切的抗運動病防止暈車、暈船的作用〔1〕。美國科學(xué)家也證明生姜確有防暈船等效果〔2〕,且相對其他防暈船藥物相比,無口干,昏睡,血壓降低等副作用。近年來,國內(nèi)學(xué)者進行的動物實驗證實,生姜的有效成分有明顯的止吐抗運動病的作用〔3〕,且無明顯副作用。南通醫(yī)學(xué)院航海醫(yī)學(xué)研究所與南通市中醫(yī)院聯(lián)合研究的生姜合劑由生姜、半夏等 6味中藥組成〔4〕,及單獨的生姜粉等用于防治運動病,效果較暈海寧強,副作用不明顯,因而生姜成為各國學(xué)者普遍看好的新的抗運動病藥物。本實驗運用乙醇法提取生姜有效成分,將其與透皮劑氮酮混合制成帖劑貼在運動病大鼠的臍部〔5〕,測定大鼠大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)、腦干前庭區(qū)腦細(xì)胞中 Na+-K+-ATP酶、堿性磷酸酶 (ALP)、細(xì)胞色素氧化酶 (CCO)活性變化〔6〕,透皮療法使藥效發(fā)揮更加持久,而且方法簡便,作用迅速〔7〕,為抗運動病新型藥物的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性 SD大鼠 40只、體重 (200±10)g,購自湖北省實驗動物中心,動物合格證號：SYXK(鄂)2003-0007,檢疫后備用。單籠飼養(yǎng),自由攝食水,飼養(yǎng) 1 w后開始實驗。隨機分 5組,分別是正常組、模型組和生姜高、中、低劑量組,每組 8只。模型組和生姜組大鼠臍部脫毛,每天將透皮貼貼在臍部,給藥 30 min。隨后給予 2 h的運動病刺激：將大鼠無束縛地放入旋轉(zhuǎn)裝置中的有機玻璃籠內(nèi),先順時針方向加速度從16°/S2加速至 120°/S2,然后立即以 45°/S2減速至 0,馬上逆時針再以 16°/S2加速至 120°/S2,然后以 45°/S2減速至 0,如此反復(fù)。旋轉(zhuǎn)時間為 2 h〔8〕,除正常組不接受旋轉(zhuǎn)刺激外,其他各組處理相同,旋轉(zhuǎn)刺激完成后動物放回飼養(yǎng)籠中。連續(xù)刺激 3 d,1次 /d。每天觀察動物接受刺激后的反應(yīng)情況,第 3天刺激結(jié)束后取動物迅速斷頭處死,冰上迅速分離腦組織,取出大鼠三部位腦組織,放入液氮,轉(zhuǎn)入 -80℃冰箱備用。

1.2 藥品與材料 生姜透皮貼：生姜 (華中科技大學(xué)鑒定)清洗去雜切碎,雙蒸水浸泡,閃式提取器提取,過濾,濾液減壓濃縮至浸膏狀,按 50、100和 200 mg/kg將生姜浸膏與氮酮混勻,制成 3 cm×4 cm生姜透皮貼,另用氮酮制作空白貼劑供模型組使用。ALP試劑盒 (批號：060101)、Na+-K+-ATP酶試劑盒(批號：060101)、CCO試劑盒 (批號：060101)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器 低溫高速離心機 (Backman)、電熱恒溫水溫箱 (上海醫(yī)療器械七廠)、721分光光度計 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng) 將組織用含 2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液固定液 (pH1.4 0.1 mol/L)4℃固定1 h。二甲砷酸鈉緩沖液漂洗后,與液氮冷凍后兩組樣品并列放在一起,恒冷箱冷凍切片為 10μm,分別測定進行 Na+-K+-ATP酶、ALP和 CCO〔9〕。用 1%鋨酸固定 1 h,EPON812包埋,LKB超薄片機切片,不進行電子染色,直接在 H ITACH I-H300型電鏡下觀察。

1.5 酶活性定量分析 采用 XY-540型彩色圖像分析系統(tǒng)定量分析〔10〕,128×128像素點,每張切片隨機測 5次,酶切片反應(yīng)至少測 30次,以陽性反應(yīng)面積 (單位為μm2)作為酶反應(yīng)強度的參數(shù),取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 大鼠受到運動病刺激后,自發(fā)活動明顯減少,皮毛蓬松聳立,排尿排便增多。運動病刺激結(jié)束后大鼠行為表現(xiàn)有所恢復(fù),約 3 h后開始活動或進食。與正常組比較,生姜組和模型組大鼠消瘦,進食量未見明顯改變。

2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)三種酶活性 運動病大鼠大腦皮質(zhì)Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應(yīng)面積明顯減小,ALP陽性反應(yīng)面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠大腦皮質(zhì)中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應(yīng)面積明顯增大,ALP陽性反應(yīng)面積減小,見表1。

表1 大鼠大腦皮質(zhì)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

表1 大鼠大腦皮質(zhì)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

與正常組比較：1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較：3)P＜0.05,4)P ＜0.01,下表同

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 90.324±23.302 100.483±71.119 59.817±14.909模型組 37.531±17.1522) 50.737±33.9712) 125.639±85.3321)生姜低劑量組 60.308±3.390 80.694±41.572 68.535±12.109生姜中劑量組 61.255±19.2794) 81.699±51.5744) 66.219±43.1063)生姜高劑量組 59.557±21.321 80.991±22.191 68.569±31.925

2.3 各組大鼠腦干前庭區(qū)三種酶活性 運動病大鼠腦干前庭區(qū)中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應(yīng)面積明顯減小,ALP陽性反應(yīng)面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠腦干前庭區(qū)中 ALP、Na+-K+-ATP酶、細(xì)胞色素氧化酶陽性反應(yīng)面積明顯增大,ALP陽性反應(yīng)面積減小,見表2。

表2 大鼠腦干前庭區(qū)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=)

表2 大鼠腦干前庭區(qū)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=)

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 70.686±15.341 151.649±10.249 98.633±49.102模型組 40.464±17.9912) 52.526±22.3472) 258.361±112.0091)生姜低劑量組 59.819±26.337 93.389±55.001 156.221±19.991生姜中劑量組 61.229±23.3694) 96.991±71.0264) 160.669±79.9123)生姜高劑量組 58.321±19.029 94.258±38.034 156.631±87.567

2.4 各組大鼠小腦皮質(zhì)三種酶活性 運動病大鼠小腦皮質(zhì)中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應(yīng)面積明顯減小,ALP陽性反應(yīng)面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠小腦皮質(zhì)區(qū)中 ALP、Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應(yīng)面積明顯增大,ALP陽性反應(yīng)面積減小 ,見表3。

表3 大鼠小腦皮質(zhì)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

表3 大鼠小腦皮質(zhì)三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 118.629±79.930 141.594±96.021 50.378±11.102模型組 0.534±12.2362) 62.632±51.0192) 82.826±15.9811)生姜低劑量組 81.265±19.556 93.559±47.108 63.676±17.438生姜中劑量組 85.335±31.4414) 95.173±33.1154) 66.779±26.1133)生姜高劑量組 80.081±55.147 94.250±19.902 62.551±36.775

3 討 論

大腦和小腦皮質(zhì)及腦干前庭區(qū)等中樞對運動病的發(fā)病有關(guān)〔11〕。ALP和 Na+-K+-ATP酶反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于以上三部位毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上,也呈陽性反應(yīng)。CCO反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于以上三部位腦細(xì)胞線粒體膜上。

旋轉(zhuǎn)刺激可引起神經(jīng)細(xì)胞膜 Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,線粒體 CCO活性下降。這可能表明旋轉(zhuǎn)刺激引起 Na+-K+泵效率明顯下降,導(dǎo)致細(xì)胞膜外 K+濃度上升,高濃度 K+可打開神經(jīng)細(xì)胞膜上電壓依賴性 Ca2+通道,導(dǎo)致 Ca2+內(nèi)流。神經(jīng)細(xì)胞膜外高 K+和細(xì)胞內(nèi)高 Na+濃度梯度是引起Ca2+內(nèi)流和神經(jīng)細(xì)胞興奮性降低的一個重要因素,ALP活性上升可能與膜的通透性增加有關(guān),同 Ca2+內(nèi)流亦相關(guān)。CCO活性降低同有氧代謝水平降低有關(guān),這可能是腦血流量減少的一個重要因素〔12〕。

何麗婭〔13～15〕等在家兔急性完全腦缺血再灌注模型上觀察生姜的腦復(fù)蘇效應(yīng),顯示生姜提取液能抑制腦組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成,提高腦組織中 SOD活性和 Na+-K+-ATP酶活性,能有效地保護缺血再灌注大腦的過氧化氫酶活性,同時改善缺血組織代謝和缺氧狀況,明顯改善細(xì)胞膜上 Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-ATP酶活性。

本實驗應(yīng)用組織化學(xué)定位方法和圖像定量分析方法,研究表明,旋轉(zhuǎn)刺激可引起大腦和小腦皮質(zhì)及腦干前庭區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,線粒體 CCO活性下降。用生姜透皮貼后,運動病大鼠三種腦組織ALP活性顯著減低、Na+-K+-ATP酶及 CCO活性明顯升高。

綜上所述,生姜提取物制成透皮貼可能通過改善腦血流分布,調(diào)整細(xì)胞內(nèi) CCO、ALP、Na+-K+-AT酶和 ALP等一系列酶活性,增強腦細(xì)胞的興奮性,從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性,起到抗運動病的作用。

盡管近年來對運動病發(fā)病機制有了較多較深入的認(rèn)識,但要清晰地闡明運動病發(fā)生的神經(jīng)通路仍有待深入的研究。隨著航空航天事業(yè)的發(fā)展,運動病的預(yù)防和治療已成為神經(jīng)科學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的重要研究課題之一〔16〕。目前對于生姜的有效成分的提取,化學(xué)成分分析,藥理作用研究和臨床應(yīng)用等方面,均取得了較大進展。本實驗使用生姜提取物制成的透皮貼,它具有吸收快、藥效持久釋放、作用效果好且無副作用等特點,為運動病的防治提供了很好的思路,為研制新型抗運動病藥物提供實驗依據(jù),下一階段將使用生姜透皮貼運用于預(yù)防和治療運動病人的實驗研究,將為運動病人帶來福音。

1 徐根興,金淑儀,董文度,等 .腦益嗪抗運動病時大鼠腦細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位的變化〔J〕.中華航海醫(yī)學(xué)雜志,1998;5(3)：129-30.

2 Zhang TY,Suen CY.A fast parallel algorithm for thinning digital patterns〔J〕.Comm ACM,1984;27(3)：236-8.

3 黃明方,侯建萍,蓋曉波,等 .生姜抗運動病研究進展〔J〕.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志,2006;6(3)：192-4.

4 姜正林,徐 兵,楊 凱,等 .生姜合劑對運動病大鼠血液腎素、血管緊張素、醛固酮水平的影響〔J〕.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志 ,2001;8(1)：15-6.

5 許守芳 .中藥敷臍治療甲氨蝶呤化療致腹瀉效果觀察〔J〕.護理學(xué)雜志 ,2004;19(5)：35-6.

6 孔曉妮,郭俊生,李 敏,等 .模擬運動病大鼠海馬組織中一氧化氮、超氧化物歧化酶、丙二醛含量的變化〔J〕.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志,2003;10(4)：193.

7 秦云峰,張小平 .中醫(yī)外治療法集萃〔M〕.呼和浩特：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社,2002：10-1.

8 姜正林,沈洪妹,楊 凱,等 .大鼠運動病模型-條件性厭食癥的建立〔J〕.中國航海醫(yī)學(xué)雜志 ,2000;7(2)：97-100.

9 徐根興 .定量細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)〔M〕.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社 ,1993：128-30.

10 寧 可 .神經(jīng)元鈣通道與 cfos原癌基因表達的關(guān)系及其在顱腦創(chuàng)傷中的意義〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·創(chuàng)傷與外科基本問題分冊,1995;16(3)：149-51.

11 雷呈祥,王國華,儲智勇,等 .速效抗暈?zāi)z囊抗運動病作用的實驗研究〔J〕.解放軍藥學(xué)報,2009;25(1)：56-8.

12 王 琰,徐根興,董文度,等 .模擬運動病 Ca2+內(nèi)流機制探討〔J〕.中國航海醫(yī)學(xué)雜志,2002;12(4)：197-200.

13 何麗婭,吳和平,黃崇新,等 .生姜對腦缺血再灌注損傷防治作用的探討〔J〕.現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),1995;12(5)：35-6.

14 何麗婭,吳和平,劉金雄,等 .生姜對家兔實驗性腦缺血再灌注損傷的復(fù)蘇療效研究〔J〕.實用中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996;9(3)：155-7.

15 何麗婭,黃崇新,李松平,等 .生姜對缺血性腦損傷時過氧化氫酶、Ca2+-ATP酶活性及乳酸含量的影響〔J〕.醫(yī)學(xué)理論與實踐,1999;12(1)：79-82.

16 Sherman CR.Motion sickness：review of canses and preventive strategies〔J〕.J Travel Med,2002;9(5)：251-6.