陳靜，王玉英，王婷婷，李峰，陸淳，朱宏

（石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司技術(shù)中心，石家莊 050221）

生鮮牛乳真蛋白快速檢測方法

陳靜，王玉英，王婷婷，李峰，陸淳，朱宏

（石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司技術(shù)中心，石家莊 050221）

建立生鮮牛乳中真蛋白快速檢測方法，運(yùn)用于牛乳中蛋白質(zhì)摻假檢測。采用紫外分光光度計(jì)，在280 nm波長處，通過吸光度值來測定真蛋白質(zhì)量濃度；采用FT-120、甲醛滴定法、凱氏定氮法進(jìn)行對比驗(yàn)證；考察人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)氯化銨、硫酸胺、尿素對真蛋白含量檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，紫外分光光度法檢測真蛋白質(zhì)量濃度與其他3種檢測方法差異不顯著；且檢測結(jié)果不受人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)的影響。紫外分光光度法檢測生鮮牛乳真蛋白質(zhì)量濃度，方法快速、可行，適用于生鮮牛乳中蛋白質(zhì)摻假檢測。

真蛋白；快速檢測；紫外分光光度法

0 引 言

真蛋白（true protein，TP）是指除了非蛋白質(zhì)氮以外的蛋白態(tài)氮所計(jì)算得到的蛋白[1]。在國家標(biāo)準(zhǔn)中，凱氏定氮法測定的是乳中總氮含量，“三聚氰胺”事件的發(fā)生，是不法分子鉆了國家標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，人為添加“三聚氰胺”以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度指標(biāo)。檢測三聚氰胺只能解決一時(shí)之需，它不能從根本上解決原料奶的質(zhì)量安全問題。因此，開發(fā)一種蛋白質(zhì)檢測方法并能防止牛乳中蛋白質(zhì)摻假，是確保乳制品質(zhì)量安全的重要課題。

本文采用紫外分光光度計(jì)，對生鮮牛乳中真蛋白的快速檢測方法進(jìn)行研究，同時(shí)通過在生鮮乳中摻加非蛋白類含氮物質(zhì)如氯化銨、硫酸胺、尿素等，考察人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)對真蛋白質(zhì)量濃度的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

質(zhì)量濃度為9 g/L氯化鈉（天津市百試化工有限公司）溶液，蒸餾水，奶廳現(xiàn)擠的純正乳（不含摻加非蛋白質(zhì)類的含氮物質(zhì)）作為標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 g/L）；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

分別吸取乳品標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，置于50 mL容量瓶中，加入氯化鈉溶液至刻度，混勻。分別吸取以上溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入氯化鈉溶液至刻度，振蕩混勻。以4 000 r/min離心10 min，備用。用氯化鈉溶液做空白調(diào)零，在280 nm波長處測得吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.2.2 樣品處理方法

取液態(tài)乳0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入質(zhì)量濃度為9 g/L氯化鈉溶液至刻度，混勻。吸取5 mL混勻的樣品溶液于50 mL容量瓶中，加入9 g/L氯化鈉溶液至刻度，振蕩混勻。以4 000 r/min離心10 min，備用。用質(zhì)量濃度為9 g/L氯化鈉溶液做空白調(diào)零，在280 nm波長處測得吸光度值。

FT-120檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照《福斯乳成分快檢測儀操作規(guī)范》中方法進(jìn)行。

甲醛滴定法[2]。

凱氏定氮法[3]參照國家標(biāo)準(zhǔn)中食品蛋白質(zhì)測定方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

蛋白質(zhì)量濃度在0.00～0.10 g/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線呈線性關(guān)系，曲線的回歸方程為：Y=0.22395X–0.00022，相關(guān)系數(shù)r=0.9991。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖1所示。

2.2 分光光度法的加標(biāo)回收率

由表1可以看出，分光光度法測得的真蛋白的加標(biāo)回收率在94.0%～106.7%之間。

表1 分光光度法測得的真蛋白的加標(biāo)回收率g/100 mL

2.3 方法的精密度

從牧場現(xiàn)擠生鮮牛乳，做精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 方法的精密度實(shí)驗(yàn)g/100 mL

由表2可以看出，此方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.071 g/100 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.23%。

2.4 生鮮牛乳中真蛋白質(zhì)量濃度的檢測

從牧場現(xiàn)擠生鮮牛乳，采用分光光度計(jì)法、FT-120法、甲醛滴定法、凱氏定氮法檢測純正牛乳中的蛋白質(zhì)含量。具體檢測結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，分光光度法測得的純牛乳中蛋白質(zhì)量濃度在2.8～3.1 g/100 mL之間，其測得的數(shù)值與FT-120測得的相比，偏差小于4.76%，與甲醛滴定方法相比，偏差小于5.41%，與國標(biāo)法相比，偏差小于5.08%。分光光度法測得的蛋白質(zhì)量濃度之所以小于FT-120、甲醛滴定和國標(biāo)法測得的結(jié)果，是由于分光光度法測得的是乳中的真蛋白，而FT-120和甲醛滴定法測得的蛋白質(zhì)量濃度是氨鍵的數(shù)目，國標(biāo)法測得的是乳中的粗蛋白。因此，采用紫外分光光度法檢測生鮮乳中的真蛋白質(zhì)量濃度比其他檢測方法低，且差異不顯著。

表3 生鮮乳中蛋白質(zhì)量濃度檢測結(jié)果g/100 mL

2.4 氯化銨、硫酸銨、尿素對檢測真蛋白質(zhì)量濃度的影響

驗(yàn)證氯化銨、硫酸銨、尿素對紫外分光光度計(jì)檢測真蛋白質(zhì)量濃度的影響。從牧場現(xiàn)擠生鮮牛乳，并人為加入氯化銨、硫酸銨、尿素等物質(zhì)，觀察真蛋白質(zhì)量濃度的變化。采用紫外分光光度法、FT-120對比檢測加標(biāo)樣品中蛋白質(zhì)量濃度，檢測結(jié)果如表4所示。

表4 加標(biāo)樣品中蛋白質(zhì)量濃度測定結(jié)果g/100mL

由表4可以看出，生鮮牛乳中添加氯化銨、尿素和硫酸胺等非蛋白類含氮物質(zhì)之后，采用FT-120法檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，能明顯增加生鮮牛乳中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；而采用分光光度法檢測蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果質(zhì)量濃度均在2.80～2.82 g/100 mL之間?？梢?，采用分光光度法檢測生鮮牛乳中真蛋白質(zhì)量濃度不受氯化銨、硫酸銨、尿素等非蛋白類含氮物質(zhì)影響。因此，采用分光光度法檢測生鮮牛乳中的蛋白質(zhì)量濃度，可以防止以含氮有機(jī)物冒充牛乳蛋白質(zhì)的違法行徑。

3 討 論

乳與乳制品中蛋白質(zhì)的測定方法有：凱氏定氮法（傳統(tǒng)的濕消化法，燃燒法）、分光光度法（考馬斯亮藍(lán)G-250法、雙縮脲法、Folin酚法（Lowry法）、BCA法和紫外吸收法）和滴定法（甲醛滴定法、pH滴定法）等[4]。在中國國家標(biāo)準(zhǔn)中，凱氏定氮法測定的是總氮含量，因此得到的結(jié)果代表的是乳中粗蛋白質(zhì)量濃度；而在國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO，AOAC，IDF）中，測定結(jié)果可真實(shí)反映乳品真蛋白的質(zhì)量濃度。我國國家標(biāo)準(zhǔn)中測定食品中蛋白質(zhì)（GB/T5009.5-2010）[3]有3種方法：凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法。正常情況下，天然乳中真蛋白的質(zhì)量濃度少于粗蛋白。由于乳與乳制品的蛋白質(zhì)中有游離的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，在280 nm波長處有特征的最大吸收，其吸收強(qiáng)度與樣品中蛋白質(zhì)含量呈正比[5]。利用這個(gè)特異性吸收，在280 nm波長處，研究采用紫外分光光度計(jì)，通過吸光度值來測定真蛋白質(zhì)量濃度。2000年，美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定以真蛋白質(zhì)量濃度作為原料乳收購的計(jì)價(jià)因子[6]，在不添加其他含氮物的條件下，它可以避免由于尿素氮的變動(dòng)造成的測定誤差，世界上越來越多的國家開始采用真蛋白質(zhì)量濃度作為計(jì)價(jià)因子（如法國、澳大利亞等）[1]。

本文采用紫外分光光度計(jì)，測定生鮮牛乳的吸光度值，建立了分光光度法測生鮮牛乳中的真蛋白質(zhì)量濃度的分析方法。分光光度法測得蛋白質(zhì)量濃度的回收率在94.0%～106.7%之間，通過精密度實(shí)驗(yàn)，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%。通過與FT-120、甲醛滴定法、凱氏定氮法測得的蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行對比，確定了分光光度法測得的蛋白質(zhì)量濃度為生鮮乳中真蛋白，并通過人為添加氯化銨、硫酸銨、尿素等物質(zhì)，確定了非蛋白類含氮物質(zhì)對分光光度計(jì)檢測真蛋白質(zhì)量濃度的結(jié)果無影響。紫外分光光度法適用于生鮮乳中蛋白質(zhì)摻假檢測，能有效制約以含氮有機(jī)物冒充蛋白質(zhì)的違法行為，確保了乳制品質(zhì)量安全。

采用紫外分光光度計(jì)法檢測牛乳中的真蛋白質(zhì)量濃度有以下2個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)[6]：真蛋白較好地反應(yīng)出乳的真正營養(yǎng)價(jià)值；非蛋白態(tài)氮不能計(jì)入蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，可以有效防止不法分子以含氮有機(jī)物冒充蛋白質(zhì)的違法行徑。因此，本方法的建立，可以快速的檢測生鮮牛乳中真蛋白質(zhì)量濃度，有效防止牛乳蛋白質(zhì)摻假。

[1]唐佳妮，呂元.國內(nèi)外乳品真蛋白檢測方法的進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（4）：119-123.

[2]田志梅.甲醛值滴定法快速測定牛奶中蛋白質(zhì)含量[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2008，20（3）：244-245.

[3]食品中蛋白質(zhì)的測定GB 5009.5-2010[S].

[4]張愛武.食品中蛋白質(zhì)測定方法的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2008（1）：81-83.

[5]田志梅，張永順.紫外分光光度法快速測定液態(tài)奶、奶粉中蛋白質(zhì)含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008,18（2）：263-264.

[6]BARBANO D M,LYNCH J M.Major Advances in Testing of Dairy Products：Milk Component and Dairy Product Attribute Testing[J].Dairy Sci.，2006,89：1189-1194.

Study on quick testing method for true protein in raw milk

CHEN Jing,WANG Yu-ying,WANG Ting-ting,LI Feng,LU Chun,ZHU Hong
（Shijiazhuang Junlebao dairy Co.Ltd,Technology Center Shijiazhuang 050221,China）

To establish a quick true protein testing method for milk protein adulteration inspection,and can be applied milk protein inspection adulteration.At 280 nm wavelength,protein content were measured by spectrophotometer.The method was compared with FT-120,formaldehyde titration and Kjeldahl methods.The addition of non-protein nitrogen material such as ammonium sulfate,ammonium chloride and carbamide was found no influence on the result.Spectrophotometory method has no significant difference with other 3 methods when it was used as a quick true milk protein testing method.The result was not interfered by addition of non-protein nitrogen material.The UV spectrophotometry determination of true protein were fast,feasible.UV spectrophotometry can be applied to raw milk in the quick testing and inspection adulteration.

true protein;quick testing；UV spectrophotometory method

TS252.7

A

1001-2230（2010）11-0050-03

2010-07-12

陳靜（1980-），女，工程師，從事乳制品檢驗(yàn)方法研究。

朱宏