孫 朋，李世昌，馬 濤

●博士（生）論壇

有氧訓練對雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChR mRNA基因表達的影響

孫 朋，李世昌，馬 濤

目的：研究有氧訓練對雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChRmRNA表達的影響。方法：24只8周齡雌性C57BL/6/Bkl小鼠分為3組，假手術安靜組（Sham，n=8）、去卵巢安靜組（OVX，n=8）、去卵巢運動組（OVX+EX，n=8）。對OVX+EX組進行8周有氧訓練（40 min/次，5天/周），采用實時熒光定量PCR方法分析ChAT、AChE、nAChRmRNA的表達量。結果：與Sham組比較，OVX組和OVX+EX組ChAT、AChE、nAChRmRNA表達均下降（P＜0.01）；與OVX組比較OVX+EX組ChAT、nAChR mRNA表達上升（P＜0.01），AChE mRNA表達下降（P＜0.05）。結論：小鼠去卵巢后ChAT、AChE、nAChRmRNA表達均有所下降，有氧訓練通過上調去卵巢小鼠海馬組織中的ChAT、nAChR和下調AChE，增強其海馬膽堿能系統(tǒng)功能。

有氧訓練；去卵巢小鼠；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，以進行性記憶能力損害和認知功能障礙為其主要的臨床特征，目前研究認為AD與中樞膽堿能系統(tǒng)的關系極為密切[1]。海馬的膽堿能系統(tǒng)直接參與信息的儲存和回憶，膽堿乙酰轉移酶（ChAT）及乙酰膽堿酯酶（AChE）是膽堿能神經元的標志酶，兩者共同維持著中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經遞質——乙酰膽堿（ACh）的動態(tài)平衡，ACh的含量與膽堿合成酶ChAT和水解酶AChE的含量和活性有關，它們在多種高級腦功能（包括學習、記憶過程）中發(fā)揮重要作用[2－3]。研究顯示，AD病人海馬區(qū)的ChAT和AChE的含量和活性出現(xiàn)異常[4]。煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）也是影響中樞膽堿能系統(tǒng)的重要因子[5－6]，相關研究研究發(fā)現(xiàn)AD病人nAChR水平出現(xiàn)下調[7－8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病率存在性別的差異，女性和男性人數(shù)之比為2∶1～3∶1[9－11]。除了女性平均壽命較長的原因外，絕經后女性體內雌激素水平的迅速下降增加了其對AD的易感性[12]。研究顯示，絕經前女性AD發(fā)病率遠遠低于同齡男性，而在絕經后女性AD的發(fā)病率迅速上升[13]，絕經后女性的發(fā)病率比同齡男性高2～3倍[11，14]。本實驗利用雌性去卵巢小鼠模擬絕經后女性，通過有氧訓練干預，檢測其海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChR mRNA的表達量。

1 研究材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)

8周齡清潔級雌性C57BL/6/Bkl小鼠24只，體重（21±2）g，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（滬）2008－0016。所有小鼠在華東師范大學動物飼養(yǎng)房分籠飼養(yǎng)，每個鼠籠4只，自由飲食，國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料（由中國科學院上海實驗動物中心提供）喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.2 方 法

1.2.1 動物模型的建立及分組 24只8周齡雌性C57BL/6/Bkl小鼠隨機分為假手術安靜組（Sham，n=8）、去卵巢安靜組（OVX，n=8）、去卵巢運動組（OVX+EX，n=8）。動物以1%的戊巴比妥鈉（0.1 g/kg）腹腔麻醉后，剃除脊柱兩側的毛發(fā)，OVX和OVX+EX組分別在脊柱兩側摘除雙側卵巢，Sham組小鼠除去雙側卵巢周圍少許脂肪組織，縫合切口，切口處給予少許青霉素粉劑。Sham組和OVX組不進行任何訓練，OVX+EX組于術后第4天進行適應性訓練兩天，休息一天后進行正式訓練。OVX+EX組以0.8 km/h的跑臺（喬山跑臺改裝成動物跑臺）速度進行訓練，每次訓練時間為40 min，每周訓練5次（周五、周六停訓），共訓練8周，訓練時間段在19：00～21：30，不使用光、電等刺激手段。

2結 果

2.1 ChAT實時熒光定量PCR檢測結果

通過分析發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠去卵巢后海馬區(qū)ChAT mRNA的相對表達量在OVX和EX+OVX組中均顯著下調（P＜0.01）。但是對去卵巢小鼠進行運動干預后，相對OVX組，EX+OVX組的ChAT mRNA相對表達量上調（P＜0.01）（見表2）。

2.2 AChE實時熒光定量PCR檢測結果

對表3分析發(fā)現(xiàn)，去卵巢可使雌性小鼠海馬區(qū)AChE mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.01）。同時發(fā)現(xiàn)，對去卵巢后雌性小鼠進行有氧運動干預的EX+OVX組比沒有進行運動干預的OVX組海馬區(qū)的AChE mRNA相對表達量要低（P＜0.05）。

注：**表示OVX組、EX+OVX組與Sham組比較，P＜0.01，▲▲表示EX+OVX組與OVX組比較，P＜0.01（下同）。

表3 小鼠海馬區(qū)AChE mRNA相對表達量Table 3 The relative amount of expression of AChE mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 1.727±0.519 1±0.218＊＊ 0.896±0.107＊＊▲▲

2.3 nAChR實時熒光定量PCR檢測結果

表4顯示，OVX和EX+OVX組海馬區(qū)nAChR mRNA相對表達量明顯低于Sham組（P＜0.01）。此外，EX+OVX組海馬區(qū)的nAChR mRNA相對表達量高于OVX組（P＜0.01）。

表4 小鼠海馬區(qū)nAChR mRNA相對表達量Table 4 The relative amount of expression of nAChR mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 3.968±0.539 1±0.164＊＊ 1.397±0.215＊＊▲▲

3 討 論

3.1 有氧訓練對ChAT的影響

在神經細胞中ChAT催化膽堿和乙酰輔酶A合成ACh。在海馬膽堿能系統(tǒng)中，ACh與ChAT高度一致，如果ChAT不足，會減少ACh的合成，導致神經元信息傳遞功能障礙，從而使學習與記憶功能減弱。AD病理生理學的主要因素就是ACh功能低下，即ChAT顯著降低造成ACh合成減少[15]。

試驗結果顯示，與Sham組對比，OVX組和OVX+EX組小鼠海馬區(qū)的ChAT mRNA表達均下調（P＜0.01）。說明去卵巢小鼠能有效模擬絕經后女性患AD的高風險因素。對去卵巢小鼠進行有氧訓練干預結果顯示，相對OVX組，OVX+EX組的ChAT mRNA表達上調（P＜0.01）。說明有氧運動能有效刺激ACh水平的限速酶ChAT的生成。Farmer的研究也發(fā)現(xiàn)，長期運動可使大鼠ChAT mRNA水平上調，增強海馬神經突觸可塑性和提高學習記憶力[16]。黃臘秀在研究不同強度運動對去卵巢大鼠ChAT表達的影響中發(fā)現(xiàn)，中等強度運動可上調去卵巢大鼠神經細胞中ChAT的表達[17]。有氧訓練通過上調小鼠海馬區(qū)ChAT，增加ACh的合成量，從而提高小鼠的學習記憶能力。Dunbar的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠訓練后，海馬區(qū)ChAT和ACh均升高[18]。張輝通過對VD大鼠進行4周的運動訓練發(fā)現(xiàn)，其學習、記憶能力明顯增強[19]。

小鼠去卵巢后海馬區(qū)ChAT下調引起ACh表達降低，從而損傷膽堿能系統(tǒng)，導致學習能力的降低。ChAT的下調可能是由于小鼠去卵巢后雌激素水平降低所引發(fā)。有氧訓練可能機制為，通過改善小鼠體內雌激素水平達到上調ChAT。大量的基礎研究顯示，雌激素能夠增加大腦皮層血液供應，提高海馬區(qū)ChAT的水平[20－21]。Greene的研究發(fā)現(xiàn)，通過有氧訓練，小鼠的E2上升，LH和FSH下降[20]。Simpkin通過給去卵巢大鼠注射E2，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)ChAT水平上調。

3.2 有氧訓練對AChE的影響

AChE是ACh的水解酶，也可作為ACh活性的標志。它能通過水解ACh，控制膽堿能神經元突觸間的信息傳遞，從而實現(xiàn)對腦功能的調控。由于AChE活性在膽堿能神經元內較高，因此其活性可以反映膽堿能神經元的活性。有研究表明，老年性癡呆病人腦組織中AChE含量顯著升高，使ACh分解速率增加，引起ACh下調，導致學習和認知能力下降[2]。有研究認為，通過測試AChE可以判斷老年性癡呆大鼠的智能及記憶損害程度[22]。

有氧訓練干預結果顯示，AChE mRNA水平上OVX+EX組表達低于OVX組（P＜0.05），說明有氧運動通過下調小鼠海馬區(qū)AChE生成量，降低ACh的水解速率，增加ACh合成量，從而增強海馬膽堿能系統(tǒng)功能，提高小鼠學習和記憶能力。通過有氧訓練干預下調AChE，調控ACh的合成量，從而預防AD的相關研究較少。大部分研究認為AChE是β－淀粉樣肽的重要組分，通過下調AChE水平可以減少β－淀粉樣肽的沉積，從而達到預防和治療AD的效果[23－24]。

3.3 有氧訓練對nAChR的影響

nAChR為配體門控的離子通道受體，屬于半胱氨酸環(huán)受體家族，廣泛分布于中樞和周圍神經系統(tǒng)中。基本結構特征為5個不同亞基組成五聚體，以五角形排列，中央形成一個離子通道。各亞基的共同結構特征是含有4個跨膜螺旋結構，其中M2跨膜區(qū)位于內側，構成離子通道的內襯面。M2螺旋上含有較多的酸性氨基酸殘基，使通道形成負電位吸引陽離子，以此構成nAChR的陽離子通道特性[25]。中樞nAChR對于神經節(jié)傳導及控制外周神經系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)的功能十分重要，在腦中參與多種復雜的學習記憶功能。早在1986年，Whitehouse就首次提出腦組織內nAChR含量下降可能引發(fā)AD。相關研究也發(fā)現(xiàn)，AD患者神經元nAChR表達降低[8]。

通過試驗結果分析，與Sham組對比，OVX組和OVX+EX組小鼠海馬區(qū)的nAChR mRNA表達均出現(xiàn)下調（P＜0.01）。相對與OVX組OVX+EX組nAChR mRNA表達上調（P＜0.01）。小鼠去卵巢后，能夠降低小鼠海馬區(qū)nAChR的表達。如果實施有氧訓練干預，可以上調去卵巢小鼠海馬區(qū)nAChR mRNA，從而提高小鼠學習記憶能力，其結果與Swain[26]的研究一致，但是其具體機制尚不完全清楚。

4結 論

有氧訓練可能通過上調雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT mRNA、nAChR mRNA和下調AChE mRNA，增加ACh合成量，增強中樞膽堿能神經系統(tǒng)的功能，從而提高其學習記憶能力。為臨床防治絕經后女性AD等認知功能障礙性疾病提供理論和實驗依據(jù)，但是其某些具體機制尚不完全清楚，有待進一步研究。

[1]王德生，張守信.老年性癡呆[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.425-442.

[2]Bartolucci C，Siotto M，Ghidini E.Structural determinants of Torpedo californica acetylcholinesterase inhibition by the novel and orally active carbamate basedanti-alzheimerdrugganstigmine（CHF-2819）[J].J Med Chem，2006，49（17）：5 051-5 058.

[3]Contestabile A，F(xiàn)ila T，Bartesaghi R，et al.Choline acetyltransferase activity at different ages in brain of Ts65Dn mice，an animal model for Down's syndrome andrelatedneurodegenerative diseases[J].J Neurochem，2006，97（2）：515-526.

[4]Kasa P，Pakonczay Z，Gluya K.The cholinergic system in Alzheimer's disease[J].Prog Neurobiol，1997，52：511-535.

[5]Lars Backman，Lars Nyberg，Ulamn Lindenberger，et al.The correlative triad among aging，dopamine and cognition：current status and future prospects[J].Neuros Biobeh Rev，2006，30：791-807.

[6]Li S C，Ulamn Lindenberger，Sverker Sikstrom.Aging cognition：from neuromodulationtorepresentation[J].Trends Cognit Sci，2001，5：497-486.

[7]wevers A，Burghaus L，MoserN，etal.Expressionofnicotinic acetylcholine receptorsinAlzheimer'sdisease：postmorteminvestigationsandexperimental approaches[J].Behav Brain Res，2000，113（l-2）：207-15.

[8]周國勇，胡森.煙堿型乙酰膽堿受體與臨床疾病[J].基礎醫(yī)學與臨床，2007，25（5）：584-587.

[9]Villarroya-Pastor M T.Profile of Alzheimer's disease in women[J].Rev Neurol，2001，32（12）：1 178-1 181.

[10]ChandraV，PandavR，Dodge HH，etal.Incidence ofAlzheimer's disease inarural communityinIndia：the Indo-USstudy[J].Neurology，2001，25（6）：985-989.

[11]Leuner B，Mendolia-Loffredo S.Shors high levels of estrogen enhance associative memory formation in ovariectomized females[J].Psycho neuro endocrinology，2004，29：883.

[12]Zandi P，Carlson M C，Plasssman B L，et al.Hormone replacement therapyandincidence of Alzheimer's disease on olderwomen：the cache countystudy[J].Jama，2002，288（17）：2 123-2 129.

[13]高飛，宋士軍，胡進中，等.去卵巢大鼠海馬及額葉皮層海馬膽堿能神經刺激肽含量的變化[J].中國老年學雜志，2009，6（29）：1326-1328.

[14]Bieber E J，Cohen D P.EStrogen and hormone replacement therapy：is there a role in the preservation of cognitive function[J].Int J Fertil Womens Med，2001，46（4）：206.

[15]王暉，徐志鵬，馮春生，等.老年大鼠麻醉后學習記憶能力與海馬乙酰膽堿含量的關系[J].中華醫(yī)學雜志，2009，89（33）：2 309-2 314.

[16]Farmer J，Zhao x，van PraagH，et al.Effects of voluntary exercise on synaptic plasticity and gene expression in the dentate gyrus of adult male Sprague-Dawleyrats invivo[J].Neuroscience，2004，124（1）：71-79.

[17]黃臘秀，陳小武.不同強度運動對去卵巢大鼠心內神經節(jié)細胞中膽堿乙酰化酶和一氧化氮合酶表達的影響 [J].中國運動醫(yī)學雜志，2006，25（2）：217-218.

[18]Dunbar G L，Rylett R J，Schnidt B M，et al.Hippocampal choline acetyltransferase activity correlates with spatial learning in aged rats[J].Brain Res，1993，604：267.

[19]張輝，張昊昕，張朝東.康復訓練對血管性癡呆大鼠認知障礙影響的NMDARI機制[J].中國老年學雜志，2007，27（5）：949-951.

[20]Greene R A.Estrogen and cerebral blood flow：a mechanism to explain the impact of estrogen on the incidence and treatment of Alzheimer disease[J].Int J FertilWomensMed，2000，45（4）：253-257.

[21]BoraS H，Liu Z，Kecojevic A，et al.complexeffects of estrogens on alas forebraincholinergic neurons[J].Exp Neuro，2005，194（2）：506-522.

[22]馬莉，趙立剛，成燕萍，等.針刺百會、大椎對老年性癡呆大鼠腦內SOD及AChE的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2008，6（2）：166-167.

[23]Bonnefont A B，Munoz F J，Inestrosa N C.Estrogen protects neuronal cells from the cytotoxicity induced by acetylcholinesterase-amyloid complexes[J].FEBS Lett，1998，441（2）：220-224.

[24]SbernaG，Saez-valeroJ，Li QX，et al.Acetylcholinesterase is increased in the brains of transgenic mice expressing the C-terminal fragment（CT100）of the beta-amyloid protein precursorof Alzheimer's disease[J].J Neurochem，1998；71（2）：723-731.

[25]Gotti C，Clementi F.Neuronal nicotinic receptors：from structure to pathology[J].Prog Neuro bio，2004，74（6）：363-396.

[26]Swain R A，Harris A R，WienerE C，et al.Prolonged exercise induces angiogenes is and increases cerebral blood volume in primary motor cortexofthe rat[J].Neuroscience，2003，117（4）：1 037-1 046.

Effect of Aerobic Training on ChAT，AChE，nAChR mRNA in Hippocampus of Female Ovariectomized Mice

SUN Peng，LI Shichang，MA Tao
（School of Sports&Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Objective：to study the effect of aerobic training on ChAT、AChE、nAChR mRNA in hippocampus of female ovariectomized mice.Methods：24 8－week－old C57BL/6/Bkl female mice were divided into 3 groups：Sham group（n=8），OVX group（n=8），OVX+EX group（n=8）.To undertake 8 weeks aerobic training（40 minutes/time，5 days/week）on the OVX+EX group，and then to analyze the ChAT，AChE，nAChR mRNA by Real－time PCR.Results：compared with Sham group，the ChAT，AChE，nAChR mRNA decreased（P＜0.01）in OVX group and OVX+EX group；compared with OVX group，the ChAT，nAChR mRNA increased（P＜0.01）and AChE mRNA decreased（P＜0.05）in OVX+EX group.Conclusion：There is a decrease expression of ChAT，AChE，nAChR mRNA in female ovariectmized mice，however，aerobic training can enhance their function of cholinergic system by increasing the expression of ChAT，nAChR and reducing AChE in hippocampus.

aerobic training；ovariectomized mice；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

G 804.2

A

1005-0000（2010）06-0515-03

2010-08-12；

2010-10-22；錄用日期：2010-10-25

孫 朋（1981-），男，山東高密人，在讀博士研究生，研究方向為運動人體科學。

華東師范大學體育與健康學院，上海200241。

1.2.2 取 材 最后一次訓練結束后第24～48 h內，小鼠斷頸處死，無菌取小鼠海馬，放入預冷的PBS緩沖液中漂洗干凈，除去血液，濾紙吸干水分，迅速放入液氮中，最后放入－80℃冷凍箱保存，用于提取RNA。

1.2.3 逆轉錄與熒光定量PCR 從－80℃冷凍箱取出海馬組織，加入液氮進行研磨，用Trizol一步法提取小鼠海馬組織的總RNA，然后應用10 μL反應體系進行逆轉錄（其中5×Preme ScriptTM Buffer，2 μL；Preme ScriptTM RT Enzyme Mi×1，0.5 μL；Oligo dT Primer（50 μM），0.5 μL；Random 6 mers（100 μM），0.5 μL）。熒光定量PCR：（1）引物設計與合成：從美國國家生物信息中心的序列資料庫（GeneBank）中查找小鼠ChAT、AChE、nAChR、Beta－actin（內參照）全基因序列，應用Primer Express 3.0軟件設計引物，引物由上海生工生物技術有限公司合成（見表1）。

表1 PCR引物一覽表
Table 1 PCR PrimerSequences and Amplicon Size

目的基因 引物 擴增片段長度ChAT 5'-AGGCCAGGACGGTCCTCTT-3' 66 5'-TGCAGCGCTCGATCATGT-3' AChE 5'-GGGCTCCTACTTTCTGGTTTACG-3' 71 5'-GGGCCCGGCTGATGAG-3' nAChR5'-AGCCTGAACGAGAAGGATGAAG-3' 63 5'-GTCGGTCCACTCCAGGTCTAAG-3' Beta-actin5'-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3' 184 5'-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3'

（2）按照Applied Biosystems StepOneTM Real－Time PCR操作要求，采用20 μL反應體系：SYBRR Premix Ex TaqTM（2×），10.0 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；ROX Reverence Dye（50×），0.4 μL；DNA模板，2.0 μL；dH2O，6.8 μL。采用兩步法PCR擴增程序：Stage 1：95℃預變性30 s；Stage 2（40Reps）：95℃變性3 s，60℃退火30 s，每1℃收集熒光。結果顯示熔解曲線只出現(xiàn)一個主波峰，說明PCR擴增的特異性較高，符合實時熒光定量PCR的技術要求。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 SPSS 11.5軟件對結果進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用One－Way ANOVA分析，并用Tukey法檢驗組間差異顯著性。檢測結果以均數(shù)±標準差（±S）表示，以P＜0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異，以P＜0.01表示在統(tǒng)計學上有極顯著性差異。