孫 朋，李世昌，馬 濤

●博士（生）論壇

有氧訓(xùn)練對雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChR mRNA基因表達(dá)的影響

孫 朋，李世昌，馬 濤

目的：研究有氧訓(xùn)練對雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChRmRNA表達(dá)的影響。方法：24只8周齡雌性C57BL/6/Bkl小鼠分為3組，假手術(shù)安靜組（Sham，n=8）、去卵巢安靜組（OVX，n=8）、去卵巢運(yùn)動組（OVX+EX，n=8）。對OVX+EX組進(jìn)行8周有氧訓(xùn)練（40 min/次，5天/周），采用實時熒光定量PCR方法分析ChAT、AChE、nAChRmRNA的表達(dá)量。結(jié)果：與Sham組比較，OVX組和OVX+EX組ChAT、AChE、nAChRmRNA表達(dá)均下降（P＜0.01）；與OVX組比較OVX+EX組ChAT、nAChR mRNA表達(dá)上升（P＜0.01），AChE mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。結(jié)論：小鼠去卵巢后ChAT、AChE、nAChRmRNA表達(dá)均有所下降，有氧訓(xùn)練通過上調(diào)去卵巢小鼠海馬組織中的ChAT、nAChR和下調(diào)AChE，增強(qiáng)其海馬膽堿能系統(tǒng)功能。

有氧訓(xùn)練；去卵巢小鼠；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，以進(jìn)行性記憶能力損害和認(rèn)知功能障礙為其主要的臨床特征，目前研究認(rèn)為AD與中樞膽堿能系統(tǒng)的關(guān)系極為密切[1]。海馬的膽堿能系統(tǒng)直接參與信息的儲存和回憶，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）及乙酰膽堿酯酶（AChE）是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，兩者共同維持著中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿（ACh）的動態(tài)平衡，ACh的含量與膽堿合成酶ChAT和水解酶AChE的含量和活性有關(guān)，它們在多種高級腦功能（包括學(xué)習(xí)、記憶過程）中發(fā)揮重要作用[2－3]。研究顯示，AD病人海馬區(qū)的ChAT和AChE的含量和活性出現(xiàn)異常[4]。煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）也是影響中樞膽堿能系統(tǒng)的重要因子[5－6]，相關(guān)研究研究發(fā)現(xiàn)AD病人nAChR水平出現(xiàn)下調(diào)[7－8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病率存在性別的差異，女性和男性人數(shù)之比為2∶1～3∶1[9－11]。除了女性平均壽命較長的原因外，絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平的迅速下降增加了其對AD的易感性[12]。研究顯示，絕經(jīng)前女性AD發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同齡男性，而在絕經(jīng)后女性AD的發(fā)病率迅速上升[13]，絕經(jīng)后女性的發(fā)病率比同齡男性高2～3倍[11，14]。本實驗利用雌性去卵巢小鼠模擬絕經(jīng)后女性，通過有氧訓(xùn)練干預(yù)，檢測其海馬區(qū)ChAT、AChE、nAChR mRNA的表達(dá)量。

1 研究材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)

8周齡清潔級雌性C57BL/6/Bkl小鼠24只，體重（21±2）g，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（滬）2008－0016。所有小鼠在華東師范大學(xué)動物飼養(yǎng)房分籠飼養(yǎng)，每個鼠籠4只，自由飲食，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料（由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供）喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.2 方 法

1.2.1 動物模型的建立及分組 24只8周齡雌性C57BL/6/Bkl小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)安靜組（Sham，n=8）、去卵巢安靜組（OVX，n=8）、去卵巢運(yùn)動組（OVX+EX，n=8）。動物以1%的戊巴比妥鈉（0.1 g/kg）腹腔麻醉后，剃除脊柱兩側(cè)的毛發(fā)，OVX和OVX+EX組分別在脊柱兩側(cè)摘除雙側(cè)卵巢，Sham組小鼠除去雙側(cè)卵巢周圍少許脂肪組織，縫合切口，切口處給予少許青霉素粉劑。Sham組和OVX組不進(jìn)行任何訓(xùn)練，OVX+EX組于術(shù)后第4天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練兩天，休息一天后進(jìn)行正式訓(xùn)練。OVX+EX組以0.8 km/h的跑臺（喬山跑臺改裝成動物跑臺）速度進(jìn)行訓(xùn)練，每次訓(xùn)練時間為40 min，每周訓(xùn)練5次（周五、周六停訓(xùn)），共訓(xùn)練8周，訓(xùn)練時間段在19：00～21：30，不使用光、電等刺激手段。

2結(jié) 果

2.1 ChAT實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

通過分析發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠去卵巢后海馬區(qū)ChAT mRNA的相對表達(dá)量在OVX和EX+OVX組中均顯著下調(diào)（P＜0.01）。但是對去卵巢小鼠進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)后，相對OVX組，EX+OVX組的ChAT mRNA相對表達(dá)量上調(diào)（P＜0.01）（見表2）。

2.2 AChE實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

對表3分析發(fā)現(xiàn)，去卵巢可使雌性小鼠海馬區(qū)AChE mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。同時發(fā)現(xiàn)，對去卵巢后雌性小鼠進(jìn)行有氧運(yùn)動干預(yù)的EX+OVX組比沒有進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)的OVX組海馬區(qū)的AChE mRNA相對表達(dá)量要低（P＜0.05）。

注：**表示OVX組、EX+OVX組與Sham組比較，P＜0.01，▲▲表示EX+OVX組與OVX組比較，P＜0.01（下同）。

表3 小鼠海馬區(qū)AChE mRNA相對表達(dá)量Table 3 The relative amount of expression of AChE mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 1.727±0.519 1±0.218＊＊ 0.896±0.107＊＊▲▲

2.3 nAChR實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

表4顯示，OVX和EX+OVX組海馬區(qū)nAChR mRNA相對表達(dá)量明顯低于Sham組（P＜0.01）。此外，EX+OVX組海馬區(qū)的nAChR mRNA相對表達(dá)量高于OVX組（P＜0.01）。

表4 小鼠海馬區(qū)nAChR mRNA相對表達(dá)量Table 4 The relative amount of expression of nAChR mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 3.968±0.539 1±0.164＊＊ 1.397±0.215＊＊▲▲

3 討 論

3.1 有氧訓(xùn)練對ChAT的影響

在神經(jīng)細(xì)胞中ChAT催化膽堿和乙酰輔酶A合成ACh。在海馬膽堿能系統(tǒng)中，ACh與ChAT高度一致，如果ChAT不足，會減少ACh的合成，導(dǎo)致神經(jīng)元信息傳遞功能障礙，從而使學(xué)習(xí)與記憶功能減弱。AD病理生理學(xué)的主要因素就是ACh功能低下，即ChAT顯著降低造成ACh合成減少[15]。

試驗結(jié)果顯示，與Sham組對比，OVX組和OVX+EX組小鼠海馬區(qū)的ChAT mRNA表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01）。說明去卵巢小鼠能有效模擬絕經(jīng)后女性患AD的高風(fēng)險因素。對去卵巢小鼠進(jìn)行有氧訓(xùn)練干預(yù)結(jié)果顯示，相對OVX組，OVX+EX組的ChAT mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。說明有氧運(yùn)動能有效刺激ACh水平的限速酶ChAT的生成。Farmer的研究也發(fā)現(xiàn)，長期運(yùn)動可使大鼠ChAT mRNA水平上調(diào)，增強(qiáng)海馬神經(jīng)突觸可塑性和提高學(xué)習(xí)記憶力[16]。黃臘秀在研究不同強(qiáng)度運(yùn)動對去卵巢大鼠ChAT表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度運(yùn)動可上調(diào)去卵巢大鼠神經(jīng)細(xì)胞中ChAT的表達(dá)[17]。有氧訓(xùn)練通過上調(diào)小鼠海馬區(qū)ChAT，增加ACh的合成量，從而提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Dunbar的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠訓(xùn)練后，海馬區(qū)ChAT和ACh均升高[18]。張輝通過對VD大鼠進(jìn)行4周的運(yùn)動訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，其學(xué)習(xí)、記憶能力明顯增強(qiáng)[19]。

小鼠去卵巢后海馬區(qū)ChAT下調(diào)引起ACh表達(dá)降低，從而損傷膽堿能系統(tǒng)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力的降低。ChAT的下調(diào)可能是由于小鼠去卵巢后雌激素水平降低所引發(fā)。有氧訓(xùn)練可能機(jī)制為，通過改善小鼠體內(nèi)雌激素水平達(dá)到上調(diào)ChAT。大量的基礎(chǔ)研究顯示，雌激素能夠增加大腦皮層血液供應(yīng)，提高海馬區(qū)ChAT的水平[20－21]。Greene的研究發(fā)現(xiàn)，通過有氧訓(xùn)練，小鼠的E2上升，LH和FSH下降[20]。Simpkin通過給去卵巢大鼠注射E2，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)ChAT水平上調(diào)。

3.2 有氧訓(xùn)練對AChE的影響

AChE是ACh的水解酶，也可作為ACh活性的標(biāo)志。它能通過水解ACh，控制膽堿能神經(jīng)元突觸間的信息傳遞，從而實現(xiàn)對腦功能的調(diào)控。由于AChE活性在膽堿能神經(jīng)元內(nèi)較高，因此其活性可以反映膽堿能神經(jīng)元的活性。有研究表明，老年性癡呆病人腦組織中AChE含量顯著升高，使ACh分解速率增加，引起ACh下調(diào)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力下降[2]。有研究認(rèn)為，通過測試AChE可以判斷老年性癡呆大鼠的智能及記憶損害程度[22]。

有氧訓(xùn)練干預(yù)結(jié)果顯示，AChE mRNA水平上OVX+EX組表達(dá)低于OVX組（P＜0.05），說明有氧運(yùn)動通過下調(diào)小鼠海馬區(qū)AChE生成量，降低ACh的水解速率，增加ACh合成量，從而增強(qiáng)海馬膽堿能系統(tǒng)功能，提高小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。通過有氧訓(xùn)練干預(yù)下調(diào)AChE，調(diào)控ACh的合成量，從而預(yù)防AD的相關(guān)研究較少。大部分研究認(rèn)為AChE是β－淀粉樣肽的重要組分，通過下調(diào)AChE水平可以減少β－淀粉樣肽的沉積，從而達(dá)到預(yù)防和治療AD的效果[23－24]。

3.3 有氧訓(xùn)練對nAChR的影響

nAChR為配體門控的離子通道受體，屬于半胱氨酸環(huán)受體家族，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中?；窘Y(jié)構(gòu)特征為5個不同亞基組成五聚體，以五角形排列，中央形成一個離子通道。各亞基的共同結(jié)構(gòu)特征是含有4個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，其中M2跨膜區(qū)位于內(nèi)側(cè)，構(gòu)成離子通道的內(nèi)襯面。M2螺旋上含有較多的酸性氨基酸殘基，使通道形成負(fù)電位吸引陽離子，以此構(gòu)成nAChR的陽離子通道特性[25]。中樞nAChR對于神經(jīng)節(jié)傳導(dǎo)及控制外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能十分重要，在腦中參與多種復(fù)雜的學(xué)習(xí)記憶功能。早在1986年，Whitehouse就首次提出腦組織內(nèi)nAChR含量下降可能引發(fā)AD。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，AD患者神經(jīng)元nAChR表達(dá)降低[8]。

通過試驗結(jié)果分析，與Sham組對比，OVX組和OVX+EX組小鼠海馬區(qū)的nAChR mRNA表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)（P＜0.01）。相對與OVX組OVX+EX組nAChR mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。小鼠去卵巢后，能夠降低小鼠海馬區(qū)nAChR的表達(dá)。如果實施有氧訓(xùn)練干預(yù)，可以上調(diào)去卵巢小鼠海馬區(qū)nAChR mRNA，從而提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其結(jié)果與Swain[26]的研究一致，但是其具體機(jī)制尚不完全清楚。

4結(jié) 論

有氧訓(xùn)練可能通過上調(diào)雌性去卵巢小鼠海馬區(qū)ChAT mRNA、nAChR mRNA和下調(diào)AChE mRNA，增加ACh合成量，增強(qiáng)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，從而提高其學(xué)習(xí)記憶能力。為臨床防治絕經(jīng)后女性AD等認(rèn)知功能障礙性疾病提供理論和實驗依據(jù)，但是其某些具體機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Aerobic Training on ChAT，AChE，nAChR mRNA in Hippocampus of Female Ovariectomized Mice

SUN Peng，LI Shichang，MA Tao
（School of Sports&Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Objective：to study the effect of aerobic training on ChAT、AChE、nAChR mRNA in hippocampus of female ovariectomized mice.Methods：24 8－week－old C57BL/6/Bkl female mice were divided into 3 groups：Sham group（n=8），OVX group（n=8），OVX+EX group（n=8）.To undertake 8 weeks aerobic training（40 minutes/time，5 days/week）on the OVX+EX group，and then to analyze the ChAT，AChE，nAChR mRNA by Real－time PCR.Results：compared with Sham group，the ChAT，AChE，nAChR mRNA decreased（P＜0.01）in OVX group and OVX+EX group；compared with OVX group，the ChAT，nAChR mRNA increased（P＜0.01）and AChE mRNA decreased（P＜0.05）in OVX+EX group.Conclusion：There is a decrease expression of ChAT，AChE，nAChR mRNA in female ovariectmized mice，however，aerobic training can enhance their function of cholinergic system by increasing the expression of ChAT，nAChR and reducing AChE in hippocampus.

aerobic training；ovariectomized mice；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

G 804.2

A

1005-0000（2010）06-0515-03

2010-08-12；

2010-10-22；錄用日期：2010-10-25

孫 朋（1981-），男，山東高密人，在讀博士研究生，研究方向為運(yùn)動人體科學(xué)。

華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241。

1.2.2 取 材 最后一次訓(xùn)練結(jié)束后第24～48 h內(nèi)，小鼠斷頸處死，無菌取小鼠海馬，放入預(yù)冷的PBS緩沖液中漂洗干凈，除去血液，濾紙吸干水分，迅速放入液氮中，最后放入－80℃冷凍箱保存，用于提取RNA。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 從－80℃冷凍箱取出海馬組織，加入液氮進(jìn)行研磨，用Trizol一步法提取小鼠海馬組織的總RNA，然后應(yīng)用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（其中5×Preme ScriptTM Buffer，2 μL；Preme ScriptTM RT Enzyme Mi×1，0.5 μL；Oligo dT Primer（50 μM），0.5 μL；Random 6 mers（100 μM），0.5 μL）。熒光定量PCR：（1）引物設(shè)計與合成：從美國國家生物信息中心的序列資料庫（GeneBank）中查找小鼠ChAT、AChE、nAChR、Beta－actin（內(nèi)參照）全基因序列，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（見表1）。

表1 PCR引物一覽表
Table 1 PCR PrimerSequences and Amplicon Size

目的基因 引物 擴(kuò)增片段長度ChAT 5'-AGGCCAGGACGGTCCTCTT-3' 66 5'-TGCAGCGCTCGATCATGT-3' AChE 5'-GGGCTCCTACTTTCTGGTTTACG-3' 71 5'-GGGCCCGGCTGATGAG-3' nAChR5'-AGCCTGAACGAGAAGGATGAAG-3' 63 5'-GTCGGTCCACTCCAGGTCTAAG-3' Beta-actin5'-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3' 184 5'-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3'

（2）按照Applied Biosystems StepOneTM Real－Time PCR操作要求，采用20 μL反應(yīng)體系：SYBRR Premix Ex TaqTM（2×），10.0 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；ROX Reverence Dye（50×），0.4 μL；DNA模板，2.0 μL；dH2O，6.8 μL。采用兩步法PCR擴(kuò)增程序：Stage 1：95℃預(yù)變性30 s；Stage 2（40Reps）：95℃變性3 s，60℃退火30 s，每1℃收集熒光。結(jié)果顯示熔解曲線只出現(xiàn)一個主波峰，說明PCR擴(kuò)增的特異性較高，符合實時熒光定量PCR的技術(shù)要求。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 11.5軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用One－Way ANOVA分析，并用Tukey法檢驗組間差異顯著性。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，以P＜0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，以P＜0.01表示在統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異。