摘 要:查爾酮合成酶是類黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。本研究克隆了洋蔥的查爾酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp，編碼393個氨基酸殘基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp，編碼391個氨基酸殘基。在同等條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。

關(guān)鍵詞:洋蔥;類黃酮;查爾酮合成酶基因;基因克隆;基因表達

中圖分類號:Q785 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0001-04

洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物，是類黃酮含量較高的蔬菜種類之一，別名洋蒜、圓蔥、蔥頭等。它以肥大的肉質(zhì)鱗莖為產(chǎn)品，根據(jù)其皮色可分為紅皮、黃皮和白皮等品種[1～3]。它是世界上重要的蔬菜作物，歐美國家譽之為“菜中皇后”。 洋蔥具有適應(yīng)性強、耐貯運、供應(yīng)期長、產(chǎn)量高、效益好等特點，不僅可以鮮食，而且還是很好的加工原料，已成為我國主要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一[4]。

類黃酮(flavonoids)是自然界中存在的酚類物質(zhì)，屬植物次級代謝產(chǎn)物。它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，對人體健康有重要影響，在防治心腦血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[5]。因此生物類黃酮已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注， 成為研究開發(fā)的熱點。

類黃酮系色原烷或色原酮的衍生物， 其基本骨架具有C6-C3-C6 的特點， 即由兩個芳香環(huán)A和B， 通過中央三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物。其生物合成前體為丙二酰CoA 和對香豆酰CoA，由查爾酮合成酶(Chalcone Synthase，CHS)催化二者形成查爾酮，再在查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone Isomerase，CHI)催化下，使查爾酮的中央三碳鏈和氧形成閉合的C環(huán)?？梢姴闋柾铣擅甘穷慄S酮基本骨架形成的第一個關(guān)鍵酶[6，7]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以洋蔥的新鮮葉片和花為材料，采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

洋蔥的總RNA用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，cDNA 第一鏈的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen，北京)完成。

1.3 PCR反應(yīng)

本研究所用的一組引物P1: 5′-CATGTCCAAGATCAACATCGATGAG-3′和P2: 5′-CAATCCCGAACGCACCCATTAACA-3′以及另一組引物P3: 5′-CACTACACTTAACTGAACCATGTC-3′和P4: 5′-CCTAACCATCAATGGCCACACT-3′，由博尚生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25 μl，其中模板cDNA 1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，引物各0.5 μl，10×Ex-Taq buffer 2.5 μl，Ex-Taq DNA polymerase(Takara，大連)0.13 μl，用滅菌蒸餾水補充至25 μl。擴增程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火 1 min，72℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán);最后72℃保溫8 min。

1.4 目的片段的克隆

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并照相記錄，分子量Marker DL2000從大到小依次為:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 擴增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進行回收，與克隆載體pMD18-T(Takara，大連)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送到博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 序列分析

序列比對在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行。生物信息學(xué)分析主要采用DNAMAN 軟件及http://www.expasy.org 、http://www.softberry.com/等鏈接的網(wǎng)上軟件進行。

1.6 基因表達半定量分析

用AcTublin作為內(nèi)標(biāo)，所用上游引物為5′-CCATCTCCTCAGGTCTCAACTTC-3′，下游引物為5′-CGCTTCGTCTTTATTGTCGCCA-3′。通過PCR產(chǎn)物條帶的亮度調(diào)整模板cDNA的濃度，使其達到一致。然后再用基因特異引物進行擴增，PCR循環(huán)25～30次，對電泳結(jié)果進行記錄和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因的克隆

洋蔥 RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分離(圖1)，再通過回收、連接、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進行序列測定。對其中一條序列進行ORF分析，發(fā)現(xiàn)有完整的開放讀碼框，其ORF序列1 182 bp，預(yù)測的蛋白質(zhì)由393個氨基酸殘基組成，將其命名為AcCHS1基因。對另一條序列進行ORF分析，發(fā)現(xiàn)其ORF序列1 176 bp，預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)由391個氨基酸殘基組成，將其命名為AcCHS2基因。

洋蔥AcCHS1和 AcCHS2基因的堿基序列相似性達到78.43%(圖2)。與網(wǎng)上洋蔥EST庫進行序列比對，結(jié)果AcCHS1基因?qū)?yīng)1條EST，AcCHS2基因?qū)?yīng)8條EST。

2.2 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因編碼蛋白的特征

將洋蔥AcCHS1基因和AcCHS2基因預(yù)測的編碼蛋白與模式植物水稻和擬南芥的CHS蛋白進行序列相似性比較(圖3)。結(jié)果顯示它們的部分區(qū)域很保守，保留了所有的高度保守的催化活性中心氨基酸殘基(半胱氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺):AcCHS1 蛋白的Cys166、Phe217、His305、Asn338和AcCHS2蛋白的Cys164、Phe215、His303、Asn336。

用Signal P3.0 Server 檢測，結(jié)果顯示AcCHS1和 AcCHS2蛋白不含信號肽序列，為非分泌蛋白。采用SOPMA 進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，AcCHS1 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(Alpha helix，40.97%)和隨機卷曲(Random coil，34.86%)以及延伸鏈(Extend strand，17.05%)和β-轉(zhuǎn)角(Beta turn，7.12%)組成。AcCHS2蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(Alpha helix，42.46%)和隨機卷曲(Random coil，33.50%)以及延伸鏈(Extend strand，17.14%)和β-轉(zhuǎn)角(Beta turn，6.91%)組成。說明兩者的蛋白二級結(jié)構(gòu)非常相似。

2.3 CHS編碼蛋白的進化樹分析

將洋蔥的查爾酮合成酶蛋白與擬南芥、大豆和高粱的查爾酮合成酶蛋白進行聚類分析。擬南芥基因組只有一個CHS基因，而在大豆和高粱基因組中CHS是多基因家族。結(jié)果(圖4)單子葉植物洋蔥和高粱聚成一個類群，雙子葉植物擬南芥和大豆聚成一個類群。并且洋蔥、大豆和高粱的CHS重復(fù)基因，都是一個物種內(nèi)的基因聚在一起。

2.4 洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因表達分析

我們利用RT-PCR的方法，用AcTublin作為內(nèi)標(biāo)，對不同皮色和不同育性洋蔥的AcCHS1和AcCHS2基因進行了表達分析。結(jié)果(圖5)顯示，洋蔥的AcCHS1和AcCHS2基因在不同皮色和不同育性的材料中，其表達沒有顯著差別;但在同等條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。這與在洋蔥基因庫中AcCHS1基因?qū)?yīng)1條EST、AcCHS2基因?qū)?yīng)8條EST結(jié)果相一致。

3 討論與結(jié)論

核酸序列和蛋白質(zhì)序列的分析結(jié)果表明，我們已成功克隆了洋蔥AcCHS1和AcCHS2基因的全長cDNA序列。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp，預(yù)測的蛋白質(zhì)由393個氨基酸殘基組成;AcCHS2的ORF序列 1 176 bp，預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)由391個氨基酸殘基組成。

查爾酮合成酶是類黃酮類物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，調(diào)控著色素合成、防御反應(yīng)、植物育性等生理生化過程。目前已從苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中克隆了約700個CHS基因及其相關(guān)基因的序列，從基因結(jié)構(gòu)看， 多數(shù)CHS基因包含1個內(nèi)含子和2個外顯子，并且內(nèi)含子的位置在所有已知序列中相同[8，9]。我們可以借鑒這些成果，設(shè)計合適的引物從洋蔥基因組DNA中擴增AcCHS1和AcCHS2基因的內(nèi)含子，并進一步進行多態(tài)性分析。

研究發(fā)現(xiàn)在多數(shù)植物基因組中存在CHS重復(fù)基因。我們已經(jīng)克隆了2個洋蔥CHS基因，是否還存在其它成員，還有待進一步的研究。這些重復(fù)基因的序列相似性往往很高，但它們的表達模式卻明顯不同[9，10]。我們也得到了類似的結(jié)果:相同條件下，AcCHS2基因的表達明顯高于AcCHS1。重復(fù)基因表達模式的分化在很大程度上受啟動子和順式調(diào)節(jié)元件的影響。下一步，我們可以用繆軍等[11]的方法，克隆AcCHS1和AcCHS2基因的啟動子，對它們的表達和調(diào)控做深入地分析。

對紫花苜蓿(Medicago sativa)的一個查爾酮合成酶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進行研究，證實其活性位點為Cys164、Phe215、His303和Asn336， 這4個氨基酸殘基在至今發(fā)現(xiàn)的所有查爾酮合成酶中均相同[12]。本研究結(jié)果也證明了這一點。這種高度一致的基因結(jié)構(gòu)說明:所有查爾酮合成酶基因可能來源于一個共同的祖先基因。

查爾酮合成酶活性的積累與類黃酮類物質(zhì)的積累是緊密相關(guān)的，因此對查爾酮合成酶的分子生物學(xué)研究可以為提高農(nóng)作物中類黃酮類物質(zhì)的合成，產(chǎn)生對人類健康有益的食品奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻:

[1] Patil B S，Pike L M，Yoo K S. Variation in the quercetin content in different colored onions(Allium cepa L.) [J]. J.Amer.Soc.Hort. Sci.，1995，120 (6):909-913.

[2] Clarke A E， Jones H A， Little T M. Inheritance of bulb color in the onion [J]. Genetics，1944，29 (6):569-575.

[3] 劉冰江，楊妍妍，吳 雄. 洋蔥品質(zhì)育種研究進展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，4:38-41.

[4] 劉冰江，楊妍妍，吳 雄. DNA分子標(biāo)記在洋蔥遺傳育種研究中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2007，5(6):118-122.

[5] 謝棒祥，張敏紅. 生物類黃酮的生理功能及其應(yīng)用研究進展[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2003，15 (2):11-15.

[6] Holton T A，Cornish E C.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell，1995，7:1071-1083.

[7] Shirley B W. Flavonoid biosynthesis:a colorful model for genetics，biochemistry，cell biology and biotechnology[J]. Plant Physiology，2001，126:485-493.

[8] 楊 繼，顧紅雅.查爾酮合酶超家族(chalcone synthase superfamily) 基因重復(fù)和分化的式樣[J]. 科學(xué)通報，2006，51(7):745-749.

[9] Sommer H ， Saedler H. Structure of the chalcone synthase gene of Antirrhinum majus[J]. Mol.Gen. Genet.，1986，202:429-434.

[10]Koes R E，Spelt C E，Reif H J，et al. Floral tissue of Petunia hybrida (V30) expresses only one member of the chalcone synthase multigene family[J]. Nucleic Acids Research，1986，14(13):5229-5239.

[11]繆 軍，霍雨猛，楊妍妍，等. 高效TAIL-PCR的改良及在洋蔥中的應(yīng)用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，10:1-4.

[12]Ferrer J L ， Jez J M ， Bowman M E ， et al . Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis[J]. Nat. Struct .Biol.，1999，6:775-784.