摘 要:煙粉虱B型和Q型是兩種入侵性較強(qiáng)的生物型，在山東省農(nóng)區(qū)混合分布。B型與Q型入侵種群的快速鑒別對(duì)于進(jìn)一步解析煙粉虱群體遺傳結(jié)構(gòu)及其防控有重要意義。在前期研究的基礎(chǔ)上，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)了國(guó)內(nèi)外27個(gè)Q型種群和1個(gè)B型種群微衛(wèi)星BEM06位點(diǎn)。結(jié)果表明:微衛(wèi)星BEM06位點(diǎn)不能有效鑒別山東省B型與Q型煙粉虱。山東省的Q型煙粉虱入侵來(lái)源與西班牙有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞:煙粉虱;微衛(wèi)星位點(diǎn);生物型;生物入侵

中圖分類號(hào):Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2010)05-0005-04

煙粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)又名棉粉虱、甘薯粉虱，是一種嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的害蟲。煙粉虱的幼蟲和成蟲通過(guò)攝取植物汁液直接危害寄主植物，還可以傳播110多種植物病毒[1]，分泌蜜露誘發(fā)霉污病影響光合作用，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)[2，3]。煙粉虱通常被視為包括許多生物型的復(fù)合種，迄今為止有30多個(gè)生物型被命名，其中B型和Q型煙粉虱是兩種入侵性較強(qiáng)的生物型。近期研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)許多地區(qū)Q型與B型混合發(fā)生并成為了煙粉虱的優(yōu)勢(shì)生物型[4]。迄今為止，國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Q型煙粉虱均為Q1型煙粉虱[5]。

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，廣泛分布于真核生物基因組中，呈孟德?tīng)柺竭z傳，可鑒別出雜合子和純合子，更能有效地揭示遺傳多樣性。微衛(wèi)星分子標(biāo)記已經(jīng)基本取代了其它標(biāo)記在生態(tài)和進(jìn)化研究中的地位，廣泛應(yīng)用于入侵生物種群來(lái)源鑒定、瓶頸效應(yīng)、雜交和基因滲透、入侵因素等許多方面的研究[6]。McKenzie等[7]研究發(fā)現(xiàn)B型煙粉虱BEM06等位基因與Q型煙粉虱(即煙粉虱Q1型[5]，包括Q2與Q3線粒體型)不同。我們前期研究[8]表明:B型煙粉虱BEM06位點(diǎn)有a、b兩種等位基因，以等位基因b為主(98.8%);而所試驗(yàn)的4個(gè)Q型種群中個(gè)體有5.6%的等位基因與B型等位基因(b)相同，且該等位基因僅存在于原產(chǎn)地西班牙1個(gè)種群，并不存在于我國(guó)云南省的Q型煙粉虱入侵種群中。因此，利用該微衛(wèi)星位點(diǎn)可以鑒別B型與我國(guó)云南省Q型煙粉虱入侵個(gè)體。

煙粉虱(B型與Q型)在山東省農(nóng)區(qū)廣泛分布[9，10]，近年來(lái)Q型煙粉虱(即Q1型)種群不斷擴(kuò)散蔓延[4，11]。B型與Q型煙粉虱的快速分子鑒定體系的建立，對(duì)于進(jìn)一步解析煙粉虱群體遺傳結(jié)構(gòu)及其防控有重要意義。微衛(wèi)星分析通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)，該方法具有分辨率高的特點(diǎn)，可以很好地將相差幾個(gè)堿基的片段區(qū)分開(kāi)。本試驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)B型、Q型煙粉虱微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM06進(jìn)行分析，旨在探索利用該微衛(wèi)星位點(diǎn)鑒別山東省B型與Q型煙粉虱入侵個(gè)體的可能性，同時(shí)基于研究結(jié)果探討山東省Q型煙粉虱的入侵來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

地中海地區(qū)及我國(guó)臺(tái)灣、美國(guó)煙粉虱樣品由澳大利亞CSIRO昆蟲所De Barro博士提供，所有種群生物型的鑒定利用mtCOⅠ引物C1-J-2195和2819-R[12]擴(kuò)增測(cè)序確定。山東各地采集的煙粉虱樣品，個(gè)體生物型的鑒定參考Khasdan等[13]和Ueda[14]的方法，利用內(nèi)切酶VspⅠ與StuⅠ為基礎(chǔ)的mtCOⅠ-CAPS。所有個(gè)體浸泡在95%酒精中，于-20℃保存?zhèn)溆?，試?yàn)共使用煙粉虱樣品387頭，其中，377個(gè)Q型個(gè)體和10個(gè)B型個(gè)體(見(jiàn)表1)。

1.2 微衛(wèi)星BEM06位點(diǎn)擴(kuò)增與檢測(cè)

單頭煙粉虱DNA的提取參照De Barro和Driver[3]的方法，PCR反應(yīng)體系包括:2 μl反應(yīng)緩沖液，1 U Taq酶，0.2 mmol/L dNTPs，BEM06上下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA為2 μl。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，條件參照De Barro等[15]的方法稍有修改，為94℃預(yù)變性5 min;94℃1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用6×的變性緩沖液于96℃變性5 min。將PCR產(chǎn)物上樣于7.0%的變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳。在1倍TBE緩沖液、恒功率70 W條件下進(jìn)行電泳后，銀染。根據(jù)等位基因的片段大小，判斷等位基因。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)了等位基因b在B型與Q型煙粉虱中的整體含量(百分比)。統(tǒng)計(jì)了等位基因b在Q型煙粉虱土著地區(qū)地中海種群中的含量及其在山東省Q型煙粉虱入侵種群中的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 B型和Q型煙粉虱的BEM06位點(diǎn)分析

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在BEM06位點(diǎn)，所選B型煙粉虱的等位基因只有b，為100.00%;而在Q型煙粉虱中，等位基因b占所有等位基因的4.56%(見(jiàn)圖1)。

2.2 Q型煙粉虱的BEM06位點(diǎn)分析

在地中海種群中，僅西班牙ES12種群檢測(cè)到20.00%等位基因b。而在山東省Q型種群中，除濟(jì)南種群(CNjn2)與德州種群(CNdz1)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該等位基因外，該等位基因在其它Q型煙粉虱種群中以6.67%～20.00%的含量存在(見(jiàn)表1)。其中，棗莊種群(CNzz1)的比例最高。

可見(jiàn)，BEM06位點(diǎn)等位基因b是西班牙Q型煙粉虱1個(gè)私有等位基因(private alleles)，在地中海其它Q型種群中并不存在。但在山東省7個(gè)地區(qū)的Q型煙粉虱中發(fā)現(xiàn)了該等位基因，這表明山東省Q型煙粉虱的入侵與西班牙Q型煙飛虱有密切關(guān)系。

3 結(jié)論

與討論鑒于煙粉虱Q型與B型的較強(qiáng)入侵性及其危害性，尋找一個(gè)簡(jiǎn)便的適用于大量煙粉虱樣品生物型鑒定的方法具有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在所選用的B型煙粉虱種群中僅有一個(gè)等位基因b。在西班牙種群ES12和山東省7個(gè)地區(qū)的Q型煙粉虱種群中，也均有等位基因b的發(fā)現(xiàn)，且在一些種群中，等位基因b的比例高達(dá)20.00%。因此，單獨(dú)使用BEM06位點(diǎn)無(wú)法有效鑒別山東省Q型與B型煙粉虱入侵種群。

利用分子遺傳學(xué)的方法，通過(guò)比較入侵物種在起源地和入侵地的遺傳相似性和私有等位基因的分布，可以確定入侵物種的來(lái)源地區(qū)[16]。Q型煙粉虱被認(rèn)為起源于地中海地區(qū)[17～19]，隨著花卉的運(yùn)輸傳入我國(guó)[20]。在本研究中，微衛(wèi)星BEM06位點(diǎn)等位基因的分布情況表明，入侵山東省的Q型煙粉虱與西班牙土著種群有密切關(guān)系。這與我們進(jìn)一步利用線粒體與微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究的結(jié)論，即山東省Q型煙粉虱可能源于地中海西部國(guó)家如西班牙、摩洛哥等地區(qū)(另文發(fā)表)是一致的。

致謝:澳大利亞CSIRO昆蟲所De Barro P.J.博士為本研究提供相關(guān)材料，在此表示感謝!

參 考 文 獻(xiàn):

[1] Jones D R.Plant viruses transmitted by whiteflies[J].European Journal of Plant Pathology，2003，109:195-219.

[2] Perring M.Identification of a whitefly species by genomic and behavioral studies[J].Science，1993，259:74-77.

[3] De Barro P J，Driver F.Use of RAPD PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae)[J].Australian Journal of Entomology，1997，36:149-152.

[4] Chu D，Wan F H，Zhang Y J，et al.Change in the biotype composition of Bemisia tabaci in Shandong Province of China from 2005 to 2008[J].Environmental Entomology，2010，Accepted.

[5] Chu D，Wan F H，Tao Y L，et al.Genetic differentiation of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype Q based on mitochondrial DNA markers[J]. Insect Science，2008，15:115-123.

[6] 褚 棟，張友軍，叢 斌，等.微衛(wèi)星分子標(biāo)記在入侵生物學(xué)中的應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，37(2):309-312.

[7] McKenzie C L，Hodges G，Osborne L S，et al.Distribution of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) biotypes in Florida-investigating the Q invasion[J].Journal of Economic Entomology，2009，102(2):670-676.

[8] 褚 棟，張友軍，高長(zhǎng)生，等.微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM06與BEM23鑒別煙粉虱B型與Q型的有效性[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2009，52(12):1390-1396.

[9] 褚 棟，周洪旭，王 斌，等.山東省煙粉虱與溫室白粉虱種群動(dòng)態(tài)及其地理分布調(diào)查[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，2:64-66.

[10]劉國(guó)霞，褚 棟，陶云荔.山東省煙粉虱地理分布及部分地區(qū)種群動(dòng)態(tài)調(diào)查[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(2):205-208.

[11]Chu D，Jiang T，Liu G X，et al.Biotype status and distribution of Bemisia tabaci (Hemiptera:Aleyrodidae) in Shandong Province of China based on mitochondrial DNA markers[J].Environmental Entomology，2007，36(5):1290-1295.

[12]Chu D，Zhang Y J，Cong B，et al. Sequences analysis of mtDNA COⅠ gene and molecular phylogeny of different geographical populations of Bemisia tabaci(Gennadius)[J].Scientia Agricultura Sinica，2005，38:76-85.

[13]Khasdan V，Levin I，Rosner A，et al.DNA markers for identifying biotypes B and Q of Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae) and studying population dynamics[J].Bulletin of Entomological Research，2005，95:605-613.

[14]Ueda S.Simple and rapid detection by mtCOⅠ PCR-RFLP to distinguish the Q biotype of Bemisia tabaci[J].Kyushu Plant Protection Research，2006，52:44-48.

[15]De Barro P J，Scott K D，Graham G C，et al.Isolation and characterization of microsatellite loci in Bemisia tabaci[J].Molecular Ecology Notes，2003，3:40-43.

[16]Miura O.Molecular genetic approaches to elucidate the ecological and evolutionary issues associated with biological invasions[J].Ecological Research，2007，22:876-883.

[17]Frohlich D R，Torres-Jerez I，Bedford I D，et al.A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers[J].Molecular Ecology，1999，8(10):1683-1691.

[18]De Barro P J，Driver F，Trueman J W H，et al.Phylogenetic relationships of world populations of Bemisia tabaci (Gennadius) using ribosomal ITS1[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2000，16(1):29-36.

[19]Boykin L M，Shatters R G Jr，Rosell R C，et al.Global relationships of Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)revealed using Bayesian analysis of mitochondrial COⅠ DNA sequences[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2007，44:1306-1319.

[20]Chu D，Zhang Y J，Brown J K，et al.The introduction of the exotic Q biotype of Bemisia tabaci from the Mediterranean region into China on ornamental crops[J].Florida Entomologist，2006，89:168-174.