摘 要:本文簡(jiǎn)要介紹了梨自交不親和性的表現(xiàn)及其調(diào)控機(jī)制，著重對(duì)梨自交親和性突變的類型、分子機(jī)制、研究進(jìn)展和研究方法進(jìn)行了概括，并對(duì)梨花粉授粉識(shí)別研究中尚待解決的問題進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞:梨;自交親和性突變;分子機(jī)理

中圖分類號(hào):S436.421.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2010)05-0026-04

植物的自交不親和性(Self-Incompatibility，簡(jiǎn)稱SI)是指能產(chǎn)生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同株植物，在自花授粉或相同基因型異花授粉時(shí)不能受精的現(xiàn)象[1]。根據(jù)花粉自交不親和性的遺傳控制機(jī)制，通常把自交不親和性分為配子體自交不親和(Gametophytic Self-Incompatibility， GSI)和孢子體自交不親和(Sporophytic Self-Incompatibility， SSI)[2]。梨(Pyrus L.)的自交不親和屬于配子體自交不親和，生產(chǎn)中必須配置授粉樹或人工輔助授粉，才能獲得產(chǎn)量。這不僅加大了果園生產(chǎn)投入、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且當(dāng)授粉樹配置不當(dāng)、人工授粉不及時(shí)或花期遭遇不良?xì)夂蚨绊懤ハx傳粉時(shí)都會(huì)造成減產(chǎn)。因此，加深對(duì)梨自交不親和性機(jī)制的認(rèn)識(shí)、研究其自交親和的機(jī)理并選育自交親和品種，顯得尤為重要。

1 梨自交不親和性的表現(xiàn)及機(jī)制

梨的自交不親和多是由單一的S位點(diǎn)控制的，這個(gè)位點(diǎn)至少包括編碼1個(gè)花柱組分和1個(gè)花藥組分的基因，也就是所謂的S基因。S基因的產(chǎn)物決定了花粉在柱頭萌發(fā)和花粉管在花柱組織中生長(zhǎng)的命運(yùn)[3]。梨屬植物自花授粉時(shí)，花粉能夠在柱頭上萌發(fā)并穿過柱頭，但花粉管在沿花柱向子房生長(zhǎng)過程中受到抑制不能到達(dá)胚珠，也就不能受精結(jié)實(shí)[5]，這屬于配子體自交不親和。

在配子體自交不親和的植物中，花粉萌發(fā)后花粉管都能夠沿花柱的引導(dǎo)組織向子房方向生長(zhǎng)，但是不親和性花粉的花粉管長(zhǎng)到一定的長(zhǎng)度后會(huì)停止生長(zhǎng)，因此S基因如何區(qū)分自花和異花花粉是配子體自交不親和研究的核心問題。由于花粉的S基因型尚未鑒定出來，嘗試去發(fā)現(xiàn)與S等位基因共分離的花粉蛋白也未成功，故無法確定控制花柱自交不親和行為的S基因是否也參與控制花粉的行為。根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們提出了花柱S-RNase抑制自花花粉管生長(zhǎng)的模型，但具體區(qū)分的分子機(jī)理尚不太清楚，目前“膜受體學(xué)說”(Receptor Model)和“胞內(nèi)抑制劑說”(Inhibitor Model)[6]這兩種假說的支持者較多。

1.1 膜受體學(xué)說

S-RNase被花粉S基因產(chǎn)生的膜受體特異性地?cái)z入，只有不親和的RNase(與花粉S基因型相同的S糖蛋白)能通過橫跨膜受體進(jìn)入花粉管并降解花粉管中的RNA。花柱內(nèi)花粉管周圍的S糖蛋白與花粉的等位基因的專一受體發(fā)生特異性反應(yīng)，選擇性地進(jìn)入自花花粉管，降解花粉管的mRNA和rRNA，從而抑制其生長(zhǎng)。但這種模型很難解釋二倍體加倍和S位點(diǎn)基因片段重復(fù)的花粉自交親和現(xiàn)象。

1.2 胞內(nèi)抑制劑說

不親和的S-RNase和親和的S-RNase都能進(jìn)入花粉管，親和的S-RNase(與花粉S基因型不相同的S糖蛋白)可以被花粉S基因編碼的一種特異的胞內(nèi)RNase抑制劑抑制而失去活力?；ǚ酃苤車腟糖蛋白均能進(jìn)入花粉管，S糖蛋白進(jìn)入帶有不同S等位基因的花粉管時(shí)，遇到高度專一性抑制物質(zhì)的抑制，但花粉管內(nèi)沒有與該花粉管相同S基因型的抑制物質(zhì)存在，從而選擇性地降解相同S基因花粉管的RNA，最終抑制花粉管伸長(zhǎng)。這種假說可以成功地解釋二倍體花粉是自交親和的原因。Luu等(2000)[7]運(yùn)用花粉管的免疫組織化學(xué)標(biāo)記方法，證明了親和的和不親和的花粉管的細(xì)胞質(zhì)中都有S-RNase的積累，這為抑制劑假說提供了佐證，但至今尚未搞清這種抑制劑為何不對(duì)自體核酸酶發(fā)生抑制。

2 梨自交親和突變的機(jī)理

梨屬于典型配子體自交不親和植物，但自然界中存在自交親和突變的品種，因此梨的自交親和性機(jī)理的研究是在對(duì)自交不親和性深入理解的基礎(chǔ)之上建立起來的。在自交不親和反應(yīng)花柱和花粉相互識(shí)別復(fù)雜過程的本質(zhì)問題中，科學(xué)家們提出了種種假說，也挖掘到了許多自然存在或人工誘變產(chǎn)生的自交親和變異品種，這無疑為自交親和性機(jī)理研究提供了寶貴的遺傳材料。

自交親和變異的途徑有自然突變和人工誘導(dǎo)突變，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的配子體型自交親和變異包括花柱變異和花粉變異，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)花柱或花粉變異導(dǎo)致的自交親和性多數(shù)是由于花柱S-RNase基因或花粉F-box基因的突變、插入、缺失引起的。

2.1 花柱變異

中國(guó)梨(Pyrus bretschneideri Rehd)‘鴨梨’(S21S34)的芽變自交親和品種‘閆莊梨’，初步推斷它的自交親和性可能是由于花柱突變所致[8]，即其花柱失去識(shí)別自己花粉的功能，而花粉行為和其原始品種相同。利用S21和S34等位基因特異性引物對(duì)‘閆莊梨’自交后代S-RNase基因型進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S21在所有后代中均有擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步證明可能是‘閆莊梨’花柱S21等位基因及其編碼產(chǎn)物發(fā)生了突變;蛋白質(zhì)印跡雜交分析結(jié)果表明，其花柱S-RNase缺失了一條帶，而沒有缺失的條帶蛋白含量也比鴨梨低。由此證明‘閆莊梨’的自交親和性可能由于花柱S-RNase的突變和表達(dá)量低所致。但尚未見報(bào)道確認(rèn)花柱S-RNase之一缺失是造成‘閆莊梨’自交親和性突變的唯一原因，或是也與另一花柱S-RNase表達(dá)量少有關(guān)。另外，在蛋白水平上是不是S21-RNase缺失和表達(dá)量降低的原因還有待基因組水平和基因轉(zhuǎn)錄水平的研究[8]。與此類似的還有日本梨品種(P.serotina)‘二十世紀(jì)’(S2S4)的無性芽變自交親和品種‘奧嗄二十世紀(jì)’。Sassa等(1997)[9]推測(cè)‘奧嗄二十世紀(jì)’自交親和的原因是花柱表現(xiàn)為S4-RNase突變的嵌合體，但不能遺傳給后代，S4-RNase基因在頂端分生組織L1、L2層缺失。吳華清等(2008)[10]通過對(duì)‘二十世紀(jì)’(S2 S4)、‘奧嗄二十世紀(jì)’(S2 S4SM)、自交后代54S -135 (S4SMS4SM)、雜交后代‘秋榮’(S4SMS5)的進(jìn)一步研究，提出了S4-RNase基因只在頂端分生組織L1層缺失的觀點(diǎn)。還有結(jié)果指出花柱S4-RNase基因缺失了236 kb序列，使得花柱S-RNase喪失了識(shí)別自己花粉的功能，其花粉S基因功能仍保持正常。

2.2 花粉突變

中國(guó)名牌梨‘鴨梨’的自然芽變品種‘金墜梨’[11]、‘黃花梨’的芽變品種‘大果黃花’[12]等就是很好的例子。吳華清等鑒定了‘鴨梨’和‘金墜梨’基于S-RNase基因的S基因型，發(fā)現(xiàn)兩者S基因型相同，均為S21S34;克隆了兩品種S-RNase基因cDNA全長(zhǎng)序列并進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩品種的1對(duì)雌蕊S -RNase基因在核苷酸序列上完全相同，且S-RNase基因均正常表達(dá)，表達(dá)量沒有明顯差異，從分子水平上證實(shí)了金墜梨在花柱方面和鴨梨并無差異，推測(cè)出可能是花粉S基因發(fā)生突變導(dǎo)致其自交不親和性功能的喪失[11]。但是由于目前花粉的S基因尚未鑒定出來，花粉S基因的表達(dá)產(chǎn)物未知，所以花粉究竟是如何突變，到底是哪個(gè)等位基因還是兩個(gè)都發(fā)生變異，有待于進(jìn)一步研究。‘黃花梨’的芽變品種‘大果黃花’與‘金墜梨’的研究結(jié)果相近。

3 梨的自交親和突變機(jī)理的研究方法

3.1 田間授粉試驗(yàn)

以突變品種和原始品種為試材，進(jìn)行自交、正反交和回交試驗(yàn)，調(diào)查花序和花朵的坐果率，推斷出自交親和的原因是源于花粉突變還是花柱突變[8～12]。具體方法是，開花前1天或當(dāng)天采集花蕾，取出花藥，室內(nèi)25℃條件下待其自然開裂，花粉散出后，收集花粉作授粉用。自花授粉時(shí)，于花朵開放前選留2～3朵邊花，其余摘除，然后套袋，待花藥散粉后，輕輕搖動(dòng)，以確保授粉和授粉量;正反交試驗(yàn)于開花前分別去雄后授粉，再套袋。自授粉當(dāng)天算起15天后調(diào)查花序和花朵坐果率。

3.2 花粉管原位萌發(fā)熒光檢測(cè)技術(shù)

授粉后96 h切取部分花朵的花柱[13]，在FAA固定液(95%酒精15 ml，冰醋酸 5 ml，福爾馬林5 ml)中固定24 h轉(zhuǎn)移到100%酒精中。固定液中取出柱頭及花柱，用清水沖洗干凈后，用NaOH溶液軟化處理，然后用苯胺藍(lán)染色液染色。經(jīng)染色處理后的花柱做成壓片，用熒光顯微鏡，觀察花粉管在柱頭上萌發(fā)和在花柱中的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行顯微拍照和測(cè)數(shù)，判斷兩品種的親和性。

3.3 S -RNase基因鑒定

采用改良的CTAB法提取葉片的DNA，根據(jù)梨S1～S7-RNase 保守序列FTQQYQ 和anti-IIWPNV設(shè)計(jì)通用引物PF(5′-TTTACGCAG2CAATATCAG-3′) 和PR (5′-ACA /GTTCGGCCAAATAATT-3′)[14]。利用DNAMAN、BioEdit分析軟件對(duì)比研究自交親和變異品種與原始品種S基因序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以期找到兩者之間的差異，并解析序列結(jié)構(gòu)差異與自交不親和反應(yīng)差異的關(guān)系。

3.4 S -RNase基因的RT-PCR檢測(cè)及全長(zhǎng)cDNA克隆

參照徐義流等(2004)[15]的方法提取花柱、花粉、子房、花瓣、萼片、幼葉等組織總RNA，參照張小燕克隆櫻桃S基因的方法[16]，設(shè)計(jì)花柱及花粉S基因的特異性引物，轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，PCR檢測(cè)花柱S-RNase與花粉F-box基因的組織特異性表達(dá)情況，并分析不同發(fā)育階段的表達(dá)差異。

3.5 花柱可溶性蛋白IEF-PAGE分析

屬于配子體自交不親和性的梨，研究其自交不親和性基因(S基因)在雌蕊花柱中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物是具有核糖核酸酶活性的糖蛋白(通常稱為S糖蛋白)，因此，通過鑒定品種的花柱S基因產(chǎn)物—S糖蛋白的種類和相對(duì)含量，就可以知道S基因在花柱中的表達(dá)情況，進(jìn)而推測(cè)自交親和性變異的原因。提取大蕾期花柱中的可溶性蛋白質(zhì)，進(jìn)行等電聚焦電泳(IEF-PAGE )分離[17]后，用銀染色譜圖中各蛋白質(zhì)的顯色帶來觀察。

4 展望

對(duì)梨的自交親和性的研究是當(dāng)前國(guó)際梨分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，梨自交不親和性機(jī)理的研究已頗為深入，特別是在雌蕊內(nèi)控制自交不親和性的基因分離及鑒定方法已日臻完善。但在梨樹育種工作中充分利用自交親和性突變，還有賴于自交不親和性調(diào)控機(jī)理的進(jìn)一步研究。目前亟需解決的問題有:①花粉中S基因的分離與鑒定;②確定花粉S基因的表達(dá)產(chǎn)物的定性和定量方法;③花粉的S基因產(chǎn)物和花柱S糖蛋白在花粉與雌蕊互作中的作用。掌握了梨的自交親和性分子機(jī)理，對(duì)培育自交親和的梨新品種具有重要理論指導(dǎo)意義，使得一個(gè)果園栽培一個(gè)品種成為可能，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)程序，降低了果園成本。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] 孟金陵. 植物生殖遺傳學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社，1995.

[2] 劉寶敬，王曉佳. 植物孢子體型自交不親和性研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，1996，8(4):38-41.

[3] 徐國(guó)華，李常青，張紹鈴. 植物自交不親和性分子機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 吉首大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，23(1):33-37.

[4] Brewbaker J L. Pollen cytology and self - incompatibility systems in plants[J ] . Hered.，1957，48:271-277.

[5] 徐義流，張紹鈴. 梨配子體型自交不親和性及其分子機(jī)理[J ].果樹學(xué)報(bào)，2003，20(1):59-63.

[6] Kao T H， McCubblin A G. Molecular and biochemical bases of gametophytic self-incompatibility in Solanaceae[J]. Plant physiol. Biochem.，1997，35(3):171-176.

[7] Luu D T， Qin X， Morse D， et al. S -RNase uptake by compatible pollen tubes in gametophytic self - incompatibility[J]. Nature，2000，407:649-650.

[8] 李曉芳，李茂福，韓振海，等.‘鴨梨’芽變‘閆莊梨’自交親和性分子機(jī)制初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35(1):13-18.

[9] Sassa H， Hirano H， Nishio T. Style-specific self-compatibility mutation caused by deletion of the S-RNase gene in Japanese pear (Pyrus serotina)[J].Plant Journal，1997，12(1):223-227.

[10]吳華清， 齊永杰， 張紹鈴.‘奧嗄二十世紀(jì)’梨自交親和性分子機(jī)制及遺傳特性研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2008，35(8):1109-1116.

[11]吳華清，張紹鈴，吳巨友，等.‘金墜梨’自交親和性突變機(jī)制的初步研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2007， 34 (2) : 295-300.

[12]吳華清，衡 偉，李 曉，等.大果黃花梨自交親和性變異機(jī)制研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(2):29-33.

[13]陶書田，張紹鈴，陳迪新，等.果梅花粉原位萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)特性的研究[J].果樹學(xué)報(bào)，2004，21(4):338-340.

[14]張妤艷，吳 俊，衡 偉，等.京白梨等品種S基因型鑒定及新基因S28和S30的核苷酸序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2006， 33(3):496-500.

[15]徐義流，張紹鈴.梨花柱RNA提取方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12(6):737-738.

[16]張小燕， 于 鵬， 李國(guó)棟，等.中國(guó)櫻桃S-RNase基因特異PCR擴(kuò)增技術(shù)體系的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，2:15-17.

[17]張紹鈴，平塚伸，徐國(guó)華，等.梨自交不親和及其親和突變品花柱內(nèi)S4SM基因的表達(dá)與作用的比較[J]. 植物學(xué)報(bào)，2001，43(11):1172-1178.