摘 要:本試驗(yàn)采用包埋玻璃化法超低溫冷凍技術(shù)保存徐薯18號(hào)的莖尖，結(jié)果表明，當(dāng)剝?nèi)∏o尖大小為1.0～1.5 mm，玻璃化處理時(shí)間為90 min時(shí)，莖尖存活率達(dá)85%以上。

關(guān)鍵詞:徐薯18號(hào);莖尖;包埋玻璃化法

中圖分類號(hào):S531.024 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2010)05-0055-02

長(zhǎng)期以來，甘薯的很多品種在推向生產(chǎn)后迅速退化，喪失新品種的優(yōu)良種性，對(duì)甘薯的產(chǎn)量與品質(zhì)造成極大影響[1]，因而如何較好地收集和保存甘薯種質(zhì)資源逐漸受到重視。目前常用的保護(hù)植物種質(zhì)資源的方法都有著各自的局限性。眾多的試驗(yàn)表明，超低溫冷凍保存植物種質(zhì)技術(shù)是較為理想的一種方法[2]。在超低溫(一般指液氮低溫，-196℃)條件下，幾乎所有的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝活動(dòng)都停止進(jìn)行，而細(xì)胞發(fā)育成完整植株的潛能和遺傳信息得以保存，更有利于保持遺傳穩(wěn)定性[3]，且超低溫條件能夠?qū)⒎N質(zhì)所感染的真菌和細(xì)菌病原物一并脫除，脫毒種質(zhì)的再生苗在一定時(shí)期內(nèi)沒有病毒、細(xì)菌和真菌病害，其生活力特別旺盛[4]。包埋玻璃化法結(jié)合了玻璃化法與包埋脫水法兩個(gè)超低溫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能在同一時(shí)間內(nèi)處理大量材料且植物恢復(fù)生長(zhǎng)較快，凍存植物莖尖不經(jīng)愈傷組織而直接成芽，其發(fā)育成的植株無形態(tài)變異且有更高的成芽率，目前已成功應(yīng)用于馬鈴薯和蘋果[5，6]等多種植物。由于莖尖分生組織細(xì)胞分化程度小，比其它組織細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳性穩(wěn)定[7]，是較為理想的超低溫保存材料，因而本試驗(yàn)采用甘薯莖尖分生組織作為試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

徐薯18號(hào)，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所甘薯室提供。

1.2 方法

1.2.1 包埋及預(yù)培養(yǎng) 在6-BA添加濃度為0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)帶芽莖段10～12 d，分別剝?nèi)〈笮?.5、1.0～1.5、2.0～3.0 mm的莖尖。將莖尖移入2.5% Na-alginate溶液中，隨后將莖尖連同Na-alginate溶液放入預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中，約20 min后形成小球(直徑約4 mm)。包埋后25℃、90 r/min預(yù)培養(yǎng)。

1.2.3 玻璃化溶液脫水 將小球移入玻璃化溶液PVS中進(jìn)行玻璃化處理，設(shè)計(jì)處理時(shí)間對(duì)比，分別為0、30、60、90、120、150 min。

1.2.4 冷凍保存 將小球快速置入液氮中，處理1 h。設(shè)置一組不經(jīng)液氮處理的對(duì)照。

1.2.5 解凍及恢復(fù)培養(yǎng) 將盛有小球的超低溫管快速轉(zhuǎn)移到38℃的水浴鍋中解凍3 min。將小球轉(zhuǎn)移到1.2 mol/L蔗糖卸載溶液中，處理20 min。將小球移入成活培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)到正常光周期培養(yǎng)7 d，置于電子顯微鏡下觀察成活狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對(duì)存活率的影響

試驗(yàn)表明，1.0～1.5 mm大小的莖尖成活率可達(dá)到80%以上， 而0.5 mm和2.0～3.0 mm莖尖成活率則低于50%(表1)。1.0～1.5 mm大小的莖尖再生能力較高[8]，且機(jī)械剝離操作較為方便簡(jiǎn)單。

2.2 玻璃化溶液處理時(shí)間對(duì)存活率的影響

玻璃化溶液即冰凍保護(hù)劑PVS，可以有效降低冰點(diǎn)，從而阻止植物體內(nèi)冰晶的形成，減少細(xì)胞的失水，降低對(duì)植物組織的傷害。處理時(shí)間過短，則不能有效地降低冰點(diǎn)，易產(chǎn)生冰晶;而由于PVS本身具有較強(qiáng)的毒性，若處理時(shí)間過長(zhǎng)，植物組織受毒害而死亡。試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，徐薯18號(hào)的最適宜處理時(shí)間為90 min，成活率達(dá)85%以上。

3 討論

徐薯18號(hào)作為淀粉型甘薯品種在全國(guó)大面積應(yīng)用，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、增產(chǎn)潛力大等特點(diǎn)，既可用作鮮食品種，又可用作淀粉加工及燃料乙醇生產(chǎn)專用品種。作為北方主栽品種，無論是在生產(chǎn)力還是品質(zhì)方面都有突出優(yōu)勢(shì)，有著較高的保存和研究?jī)r(jià)值，因而為本試驗(yàn)所采用。

超低溫冷凍保存種質(zhì)在多種植物中都早有研究，但在甘薯中的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)針對(duì)不同品種，在操作過程中對(duì)其冰凍前的馴化、冷凍處理時(shí)間及其再生條件進(jìn)行了優(yōu)化組合配置，獲得了較為適宜的配置條件。且本試驗(yàn)選用莖尖的分生組織為材料，細(xì)胞分化程度小，在再生過程中比其它組織細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳性穩(wěn)定，并有著更高的再生效率，更有利于種質(zhì)的優(yōu)良品質(zhì)保存。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] 李洪民，邢繼英，馬代夫，等.甘薯抗病毒種質(zhì)資源的鑒定與篩選[A]. 中國(guó)甘薯育種與產(chǎn)業(yè)化學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].成都，2005，17-21.

[2] 吳雪梅，湯浩茹.包埋玻璃化法超低溫保存植物種質(zhì)的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22 (2): 238-245.

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