摘要：為證實(shí)微生物菌對(duì)土殘農(nóng)藥有較好的降解作用，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)室和大田土壤的農(nóng)藥降解試驗(yàn)。結(jié)果表明，水解試驗(yàn)中，EM菌和枯草芽孢桿菌對(duì)辛硫磷、丙溴磷降解比較明顯；枯草芽孢桿菌對(duì)土壤中受試農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷具有較強(qiáng)的降解能力，同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌降解土殘農(nóng)藥的用量做了初步研究。

關(guān)鍵詞：微生物菌劑；EM菌；枯草芽孢桿菌；土殘農(nóng)藥；降解

中圖分類號(hào)：X592 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001－4942(2010)04－0075－04

化學(xué)農(nóng)藥以其見(jiàn)效快、防治譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、便于貯運(yùn)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在防治農(nóng)作物病蟲草害及消滅衛(wèi)生害蟲、疾病等方面發(fā)揮著巨大作用，促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。有機(jī)磷農(nóng)藥在我國(guó)應(yīng)用較為廣泛，2005年，我國(guó)農(nóng)藥總產(chǎn)量為103.9×104 t，其中有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)品占總量的70％。但是，大量使用農(nóng)藥也帶來(lái)了環(huán)境污染、殺傷天敵和病蟲草害產(chǎn)生抗藥性等副作用，導(dǎo)致了農(nóng)藥殘留(以下簡(jiǎn)稱農(nóng)殘)增加、地力減退及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等不良后果，特別是毒性大、性質(zhì)穩(wěn)定的農(nóng)藥農(nóng)殘期長(zhǎng)且不易降解，給人類健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。我國(guó)土壤的農(nóng)藥污染問(wèn)題日益突出，土壤環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品安全已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。對(duì)土壤的農(nóng)藥污染可進(jìn)行物理、化學(xué)和生物修復(fù)，微生物以其生長(zhǎng)繁殖速度快、代謝類型多、能降解多種農(nóng)藥進(jìn)行生長(zhǎng)的特點(diǎn)而逐漸成為化學(xué)農(nóng)藥的克星。微生物的降解作用是對(duì)土壤中農(nóng)藥最主要也是最徹底的凈化。微生物對(duì)土壤中農(nóng)藥的降解反應(yīng)較多，也很復(fù)雜，其中比較重要的微生物降解反應(yīng)有氧化、還原、水解、開(kāi)環(huán)作用等。而對(duì)農(nóng)藥有降解能力的微生物有細(xì)菌、放線菌、真菌等。因此我們利用微生物對(duì)農(nóng)藥的降解作用進(jìn)行了治理土壤農(nóng)藥污染的試驗(yàn)。利用生物本身或生物產(chǎn)品來(lái)降解污染物的生物修復(fù)方法具有無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，是消除農(nóng)藥殘留或者降低殘留農(nóng)藥毒性的一種相對(duì)廉價(jià)而有效的方法，微生物菌劑做肥料施用時(shí)不同程度地表現(xiàn)出對(duì)作物病蟲害的抑制作用。利用枯草芽孢桿菌降解土壤中農(nóng)藥技術(shù)研究具有十分重要的意義。本試驗(yàn)為進(jìn)一步探索受農(nóng)藥污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種與菌劑

供試菌種為人工分離篩選培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌和EM菌，由曹州農(nóng)化公司和臺(tái)灣百泰生物科技有限公司提供?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)Y1336作為一種復(fù)合生物菌劑，含有多種從土壤中篩選出來(lái)能促進(jìn)作物生長(zhǎng)并抑制病原菌繁殖的菌種，不僅為作物提供養(yǎng)分以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，還能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)以抑制土壤有害病原微生物的繁殖，收到很好的土壤生物污染防治效果。EM菌種由雙歧菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、放線菌、醋酸菌等單一菌種經(jīng)特殊工藝研制而成的高效復(fù)合微生物菌種。以上兩個(gè)菌種每克含有益總菌數(shù)≥100×10個(gè)。

微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥的作用方式可分為兩大類，一是微生物直接作用于有機(jī)磷農(nóng)藥，通過(guò)酶促反應(yīng)降解農(nóng)藥，常說(shuō)的微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥多屬于此類；二是通過(guò)微生物的活動(dòng)改變了化學(xué)和物理的環(huán)境而間接作用于有機(jī)磷農(nóng)藥，一般有礦化作用、共代謝作用、生物濃縮或累積作用及其它的間接作用等。

1.2 試驗(yàn)土壤

試驗(yàn)地選在菏澤市牡丹區(qū)李丁樓村，土壤為壤質(zhì)潮土，pH值為7.4，土壤有機(jī)質(zhì)含量為11.5g/kg。試驗(yàn)用的土壤樣品為經(jīng)風(fēng)干過(guò)10目篩的土壤。

1.3 樣品中農(nóng)藥殘留測(cè)定

試驗(yàn)用農(nóng)藥為辛硫磷、丙溴磷、甲基對(duì)硫磷。樣品中農(nóng)藥殘留測(cè)定采用高效液相色譜法。

儀器：具UV-254 nm檢測(cè)器。

色譜柱：150 mill×4，6 r/lr/l(id)不銹鋼柱，內(nèi)裝Zorbax C18填充物，5 μm；色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)。

高效液相色譜操作條件：流動(dòng)相為甲醇+水=75+25(V/V)；流量1.0 ml/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10μl；辛硫磷的保留時(shí)間3.865 min，丙溴磷的保留時(shí)間7.948 min，甲基對(duì)硫磷的保留時(shí)間6.328 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑對(duì)水體中農(nóng)藥的降解效果

兩種農(nóng)藥分別設(shè)3個(gè)處理，對(duì)照均為純凈水，處理1加入EM菌1g/kg，處理2加入枯草芽孢桿菌1g/kg，試驗(yàn)前辛硫磷濃度均為1024 mg/kg、丙溴磷1023 mg/kg，加入菌劑20天后，分別測(cè)各處理農(nóng)藥濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，辛硫磷、丙溴磷在水體(CK)中降解非常緩慢，20天后濃度變化很小，濃度分別下降3 mg/kg和5 mg/kg，而加入枯草芽孢桿菌和EM菌的樣品，農(nóng)藥濃度顯著降低，加入枯草芽孢桿菌的辛硫磷濃度降至468 mg/kg、丙溴磷降至504 mg/kg，加入EM菌的辛硫磷濃度降至518mg/kg，丙溴磷降至625 mg/kg，均達(dá)到農(nóng)藥原濃度的1/2。從表1中還可看出，加入枯草芽孢桿菌的處理降解要快于加入EM菌的處理。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解效果

2.2.1 降解茵性能試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌在水體中生長(zhǎng)的最適pH值為7.5；在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出良好的降解性能，pH 7.0時(shí)其對(duì)農(nóng)藥降解效果更好，故選擇pH 7.0～7.5為最佳酸度條件。

溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，其適宜生長(zhǎng)溫度為25～35℃。最適生長(zhǎng)溫度為30℃。水解試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度在25℃時(shí)，枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出高效的降解能力，故認(rèn)為環(huán)境溫度選擇在25~35~C為宜。

在實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)了枯草芽孢桿菌對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的降解性能，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌具有非常強(qiáng)的降解目標(biāo)農(nóng)藥(甲基對(duì)硫磷)的能力，是一株比較理想的降解菌。在水解試驗(yàn)中，甲基對(duì)硫磷在水體中降解非常緩慢，21天后濃度變化很小，求出的t1/2為46.5天；加入枯草芽孢桿菌后，其濃度顯著降低，求出的t1/2為11天左右。在土壤降解試驗(yàn)中，也表現(xiàn)出相當(dāng)高效的降解能力。當(dāng)土壤中甲基對(duì)硫磷濃度低于500 mg/kg，加入枯草芽孢桿菌后，24 h降解率達(dá)45.0％～49.2％，而相應(yīng)未投加降解菌的對(duì)照土壤中僅為10％。

2.2.2 降解茵在不同土壤環(huán)境中對(duì)農(nóng)藥的降解作用

(1)枯草芽孢桿菌在滅菌土壤中對(duì)農(nóng)藥的降解效果

稱取過(guò)10目篩的土壤1 kg裝盆，用紗布包扎盆口，用Co-γ射線進(jìn)行輻照滅菌。在超凈工作臺(tái)上加入農(nóng)藥和菌懸液，同時(shí)設(shè)不接種為對(duì)照。置25℃條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定土壤中農(nóng)藥的含量，結(jié)果顯示，在滅菌土壤中農(nóng)藥的降解非常緩慢，在8天中農(nóng)藥只降解了8.5％，而接種菌以后，土壤中農(nóng)藥的降解非常迅速，在4天內(nèi)農(nóng)藥即降解到檢測(cè)限以下。這充分說(shuō)明土壤中農(nóng)藥的降解作用是由外加微生物引起的。

(2)枯草芽孢桿菌在非滅菌土壤中對(duì)農(nóng)藥的降解效果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在自然非滅菌土壤中農(nóng)藥的降解要比滅菌土壤中快得多。這是因?yàn)檗r(nóng)藥在自然土壤中，除了化學(xué)降解及物理降解外，還有土壤微生物的作用。而接種了枯草芽孢桿菌后，土壤中農(nóng)藥的降解則更為迅速。在培養(yǎng)1.5天后，自然土壤中農(nóng)藥只降解了24.4％，而在接菌的土壤中農(nóng)藥已降解了62.1％。到第5天，接菌的土壤中已經(jīng)檢測(cè)不到農(nóng)藥，而在自然土壤中同樣的過(guò)程則需要12天。這表明在接菌土壤中，接種的微生物對(duì)土壤中農(nóng)藥降解的作用是明顯的，接種降解菌可以大大加速農(nóng)藥的降解。

2.2.3 茵劑不同用量對(duì)土壤中農(nóng)藥的降解效果

先用一定量的水將土壤潤(rùn)濕，然后稱重，將土壤置于燒杯中，每處理裝土100 g(5個(gè)處理)，然后從上面均勻地滴加農(nóng)藥，使各處理土壤初始農(nóng)藥濃度均為50 mg/kg(以干土計(jì))。再均勻地滴加不同量的菌劑(5、1、0.5、0.1 m1，CK)，并使各處理土壤的水分保持一致，室溫放置3天，測(cè)定各處理土壤中農(nóng)藥的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，加入降解菌可大幅度提高降解率。經(jīng)過(guò)3天時(shí)間，未加菌的對(duì)照土壤中農(nóng)藥降解率僅為31.0％，而4種不同菌劑量的處理，降解率均達(dá)到了82.3％以上，表明該菌對(duì)農(nóng)藥降解率隨菌劑量的增加而提高。但是，當(dāng)菌劑量達(dá)到一定程度后，降解率增加的趨勢(shì)變緩。當(dāng)菌劑量從0.1 ml增加到0.5 ml時(shí)，降解率的增加值為5.6個(gè)百分點(diǎn)，而菌劑量從1 ml增加到5 ml時(shí)，降解率的增加值則僅為0.2個(gè)百分點(diǎn)。所以，在某一處理?xiàng)l件下，存在一個(gè)最佳菌劑用量。

2.2.4 菌劑加入方式對(duì)土壤中農(nóng)藥的降解效果

微生物對(duì)農(nóng)藥的降解效果因農(nóng)藥及降解菌加入方式不同而有很大差異，這是因?yàn)檗r(nóng)藥和降解菌在土壤中的移動(dòng)性，加入方式直接影響到農(nóng)藥與降解菌的有效接觸。為此探討了農(nóng)藥與微生物的有效接觸問(wèn)題。分別討論了兩種情況：

(1)農(nóng)藥和菌劑同時(shí)都從土柱上部加入

先用一定量的水將土壤潤(rùn)濕，然后稱重，用等量的土制成2個(gè)土柱，分別從上面加入等量的農(nóng)藥，其中一個(gè)土柱從表層均勻滴加菌劑，另一土柱則均勻滴加等量的水。然后于室溫放置3天。3天后將2個(gè)土柱分成上、中、下3層分別取樣，每層3 cm，分別測(cè)定各層土壤中的農(nóng)藥含量。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在未加菌的土柱中，甲基對(duì)硫磷絕大部分集中分布在0～3 cm的上層，土壤中農(nóng)藥含量為98.3 mg/kg，而中層和下層土壤中的農(nóng)藥含量則很低，分別為0.994 mg/kg和0.172mg/kg。這表明該農(nóng)藥的移動(dòng)性較差，極易被上層土壤吸附。而在加菌土柱中，3層土壤中農(nóng)藥的含量都很低，上層土壤中農(nóng)藥含量為46.4 mg/kg，中層和下層土壤中的農(nóng)藥含量分別為0.584 mg/kg和0.155 mg/kg。表明吸附在土壤上層中高濃度的農(nóng)藥已被枯草芽孢桿菌降解。

(2)茵劑在土壤垂直方向的移動(dòng)性

先將受試農(nóng)藥與土壤充分拌勻，使土壤中農(nóng)藥的初始濃度為50 mg/kg(以干土重計(jì))，然后將土壤分成等量的2份制成2個(gè)土柱，其中一個(gè)土柱由土壤上部加入菌劑，另一個(gè)土柱不加菌，而加入等量的水。然后于室溫條件下放置3天。3天后將2個(gè)土柱分成上、中、下3層分別取樣，每層3 cm。

測(cè)定結(jié)果顯示，未加菌的各層土壤中農(nóng)藥含量較為接近，但有微小差別，即上層<中層<下層，這是由于表層土壤的光照及通氣條件都優(yōu)于下層土壤，農(nóng)藥的自然降解作用相對(duì)較強(qiáng)之故。

加菌土柱各層中農(nóng)藥含量與未加菌的土柱相比，其上層和中層土壤中農(nóng)藥含量大幅度降低，降解率比未加菌的土柱分別高59％和38％，而下層土壤中農(nóng)藥含量仍很高。由此可以推斷，當(dāng)從土壤表層加入菌劑時(shí)，降解菌有一定的移動(dòng)范圍，在本試驗(yàn)條件下降解菌的活動(dòng)范圍為上層和中層土壤，即降解菌可達(dá)6 cm的深度。

2.3 噴施菌劑對(duì)土壤中農(nóng)藥的降解效果

試驗(yàn)時(shí)間選在7月15日至8月2日，氣溫28～34℃。試驗(yàn)地點(diǎn)為菏澤市牡丹區(qū)李丁樓村，土壤為壤質(zhì)潮土。每處理的試驗(yàn)小區(qū)面積為2 m²。土壤中農(nóng)藥為人為施的甲基對(duì)硫磷，農(nóng)藥濃度設(shè)計(jì)為22.5 kg/hm²。菌劑用量設(shè)計(jì)為5、10、15、30和40 kg/hm²。農(nóng)藥和菌液分別用壓力噴霧器均勻噴施，噴施農(nóng)藥1天后噴施菌液，定期采集土樣測(cè)定其農(nóng)藥含量。48 h試驗(yàn)測(cè)定顯示，降解菌對(duì)受試土壤中農(nóng)藥具有很好的降解作用。隨著菌劑用量的增加，土壤中農(nóng)藥降解效果越明顯。當(dāng)菌劑用量為15 kg/hm²時(shí)，48 h后降解率已達(dá)45.9％；當(dāng)菌劑用量為30 kg/hm²時(shí)，降解率達(dá)65.2％；隨后菌劑量的增加對(duì)土壤中農(nóng)藥的降解率效果不大。所以在本試驗(yàn)條件下，選擇菌劑用量30 kg/hm²為最佳用量。

在實(shí)際應(yīng)用中，須根據(jù)土壤中農(nóng)藥含量多少，適當(dāng)選擇最佳菌劑用量，才能達(dá)到預(yù)期的降解去除效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)分別探討了EM菌和枯草芽孢桿菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解性能，研究結(jié)果表明，水解試驗(yàn)中，EM菌和枯草芽孢桿菌對(duì)辛硫磷、丙溴磷降解比較明顯，枯草芽孢桿菌對(duì)土壤中受試農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷具有較強(qiáng)的降解能力，在本試驗(yàn)條件下，最適菌劑用量約30 kg/hm²，對(duì)土壤中農(nóng)藥降解去除率達(dá)80％以上。