摘要：為探明番茄在溫度逆境下抗壞血酸(AsA)代謝系統(tǒng)抗氧化的生理機(jī)制，以番茄幼苗為試材，分別研究了高溫(40℃)和低溫(5℃)脅迫(0、4、8、12、24、36 h)下，葉片AsA代謝的主要酶L－半乳糖－1，4－內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、抗壞血酸過氧化物酶(APx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性與AsA、脫氫抗壞血酸(DHA)和AsA+DHA含量的變化。結(jié)果表明：在高溫和低溫脅迫下，除36 h外，番茄葉片AsA、DHA和A8A+DHA含量和GalLDH、DHAR、APX、MDHAR及GR活性均明顯高于25℃(CK)處理，H2O2含量始終明顯高于CK，AsA/DHA始終明顯低于CK，說明短時間(24 h)高溫和低溫脅迫，番茄幼苗以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)功能明顯增強(qiáng)，但長時間(36 h)溫度脅迫，AsA抗氧化系統(tǒng)的功能明顯下降，導(dǎo)致H2O2的積累。

關(guān)鍵詞：番茄；高溫；低溫；抗壞血酸；抗壞血酸系統(tǒng)

中圖分類號：S641.201 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942(2010)04-0022-05

番茄屬喜溫不耐熱的蔬菜，夏秋露地以及日光溫室和大棚栽培，常遇35℃以上高溫，往往導(dǎo)致其生育異常；番茄對低溫也較敏感，8℃時生長發(fā)育嚴(yán)重受阻，5℃時生長完全停止。因此，溫度逆境成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。

高溫和低溫均會導(dǎo)致植物活性氧自由基積累，進(jìn)而形成氧化脅迫。通過調(diào)節(jié)自身的抗氧化系統(tǒng)，植物可清除活性氧自由基而免受或減少傷害。以抗壞血酸(AsA)為核心的抗氧化系統(tǒng)在植物清除活性氧過程中具有重要的作用。植物AsA代謝途徑已較為明確，AsA主要是通過半乳糖途徑合成，L一半乳糖－1，4-內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)為催化該途徑最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。AsA在抗壞血酸過氧化物酶(APX)作用下氧化生成單脫氫抗壞血酸(MDHA)。MDHA經(jīng)非酶歧化反應(yīng)形成脫氫抗壞血酸(DHA)。兩者分別通過單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)的作用被還原再生。因此，GalLDH、APX、MDHAR、DHAR和GR為影響AsA代謝的重要酶，并被證明參與植物對活性氧的清除作用。

目前，有關(guān)番茄在溫度逆境下AsA代謝系統(tǒng)的變化尚未見報道。本試驗(yàn)以番茄幼苗為試材，旨在探明其在溫度逆境下AsA代謝系統(tǒng)抗氧化的生理機(jī)制，以期為番茄在栽培中抵御溫度脅迫提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試材番茄品種為“S以12粉”，由青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所提供。選取飽滿種子，催芽后播種在含草炭、蛭石和羊糞(體積比為3：2：1)的營養(yǎng)缽中。待植株長至7～8片真葉時，選長勢一致者移至光照培養(yǎng)箱[光照強(qiáng)度55.63μmol/(m²·s)]進(jìn)行溫度脅迫。設(shè)25℃(CK)、40~C(高溫)和5~C(低溫)3個處理。均于處理的0、4、8、12、24和36 h，分別取幼苗頂端下第3～4片葉測定各項(xiàng)指標(biāo)。每處理重復(fù)3次，樣品經(jīng)液氮冷凍后，－80℃超低溫冰箱保存。

1.2 測定方法

1.2.1 酶活性測定 GaILDH和MDHAR活性分別采用Tabata等(2001)和Jim6nez等(1997)的方法測定；GR、APX活性參照Pignocchi等(2006)的方法測定。

DHAR活性參照Chen等(2003)的方法加以改進(jìn)。取0.5 g番茄葉片在4 ml提取緩沖液(含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol/L NaCI，2 mmol/L EDTA和l mmol/L MgCl2)研磨勻漿，12 000×g離心10 min。取100μl提取液，加1.9 ml反應(yīng)液(含25 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.0，0.1 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L GSH，0.4 mmol/L DHA)。紫外分光光度計測定265 nm下吸光值變化。

1.2.2 AsA、DHA和AsA+DHA含量測定AsA含量測定參考Tures(myi等(2000)及Takahama和Onik(1992)提供的方法并作適當(dāng)改進(jìn)：稱取約0.5 g番茄葉片在5％的偏磷酸中研磨勻漿，于4℃下12 000×g離心20 min，收集上清液用于測定AsA和DHA的含量。測定AsA時，吸取一定量的如上提取液加至100 mmol/L磷酸鉀緩沖液2Inl(pH 6.8)中，當(dāng)加入1 u的抗壞血酸氧化酶(EC 1.10.3.3，from Cucurbita sp.)后記錄265nm下的吸光值變化。測定DHA時，吸取一定量提取液加至100 mmol/L磷酸鉀緩沖液2 ml(pH6.8)中，當(dāng)加入2 mmo~L DTr后開始記錄265nm下的吸光值變化。同時，用一系列已知濃度的AsA和DHA(sigma)溶液用相同的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線以計算樣品中AsA、DHA和AsA+DHA含量。

1.2.3 H2O2含量測定H2O2的測定參照Petrie和Jaekson(1984)的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件分析數(shù)據(jù)和做圖，采用DPS統(tǒng)計軟件中的Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫下AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA比值

如圖1所示，CK(25℃)番茄葉片AsA含量變化不大，但40℃和5℃兩者AsA含量均呈先增加后下降趨勢，且均在脅迫的12 h達(dá)到高峰，分別較CK增加58.3％和33.3％，而后急劇下降。CK番茄葉片DHA含量變化不大，但40℃和5℃兩處理DHA含量均呈先增加后下降趨勢，且在脅迫的12 h達(dá)到高峰，分別較CK增加72.9％和61.6％，而后急劇下降，但40℃處理最終仍顯著高于CK。AsA+DHA含量變化趨勢與DHA含量基本一致；而AsA/DHA比值在40℃和s℃脅迫下。均始終明顯低于CK。

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2.2 溫度脅迫下GalLDH活性

如圖2所示，40℃和5℃下，番茄葉片GalLDH活性變化基本一致，脅迫的4 h內(nèi)均變化不大，但隨后均急劇增加至12h達(dá)到高峰，分別比CK增加139.5％和113.3％，而后又急劇下降，36h時顯著低于CK；但CK番茄葉片GalLDH活性在處理過程中變化很小。

2.3 溫度脅迫下MDHAR和DHAR活性

如圖3所示，40℃和5℃下，番茄葉片MDHAR活性具有相同的變化規(guī)律，均呈單峰曲線，在12 h達(dá)到高峰，分別比CK增加152.3％和130％。之后迅速下降，在36 h顯著低于CK。DHAR活性變化和MDHAR活性變化規(guī)律基本一致，在12 h達(dá)到最高值，分別比CK增加220.1％和173.8％，之后迅速下降。由圖3可明顯看出，CK番茄葉片MDHAR和DHAR活性在處理過程中均變化很小。

2.4 溫度脅迫下APX活性

如圖4所示，40％和5℃兩處理的番茄葉片APX活性均始終明顯高于CK，在8 h內(nèi)兩處理APX活性增加緩慢，隨后增加迅速，在12 h達(dá)到高峰，分別比CK增加147％和155.8％，之后迅速下降，但36 h時仍顯著高于CK。

2.5 溫度脅迫下GR活性

由圖5看出，40℃和5℃下，番茄葉片GR活性均逐漸增加，12 h達(dá)到高峰，分別比CK增加62.4％和36.7％，之后迅速下降，在36 h均顯著低于CK，但CK番茄葉片GR活性在處理過程中變化很小。

2.6 溫度脅迫下H2O2含量

如圖6所示，40℃和5℃兩處理的番茄葉片H2O2含量均始終明顯高于CK，兩者均快速增加，8h達(dá)到高峰，分別比CK增加47.6％和52.2％，12 h后明顯下降，24 h后40℃處理H2O2含量又明顯增加，而5℃處理變化不大。

3 討論與結(jié)論

溫度逆境對植物的傷害涉及到其體內(nèi)一系列生理效應(yīng)的變化，而活性氧的積累及其所引起的氧化脅迫被認(rèn)為是植物受冷熱傷害的重要原因。因此，作為植物體內(nèi)重要的抗氧化物，抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種高豐度小分子抗氧化物質(zhì)，可以直接清除O2·)、H2O2和·OH等活性氧自由基(ROS)，其中一個重要功能是保護(hù)葉綠體免于氧化損傷，因此在植物抵抗生物和非生物脅迫中具有重要作用。相當(dāng)多的研究資料表明，AsA的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA)及其合成代謝相關(guān)酶類活性的變化是植物對一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，番茄在高低溫脅迫下，AsA含量及其代謝相關(guān)酶活性顯著增加，說明以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)參與了清除活性氧，提高了番茄的抗性。

H2O2被認(rèn)為是一種導(dǎo)致植物氧化脅迫的活性氧分子和植物細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境變化所產(chǎn)生的重要信號分子。本試驗(yàn)中，在高溫和低溫脅迫初期，番茄葉片H2O2含量均迅速增加，誘發(fā)了以AsA為核心的代謝相關(guān)酶活性的迅速增強(qiáng)，AsA及AsA庫含量也逐漸增加。同時APX活性增強(qiáng)，AsA參與H2O2的清除被消耗，其最終產(chǎn)物DHA含量不斷增加，AsA/DHA快速降低。說明在溫度脅迫下，以AsA為核心的抗氧化酶系統(tǒng)參與了番茄抵御高溫和低溫逆境的自我保護(hù)反應(yīng)，并通過調(diào)節(jié)AsA水平，保護(hù)植株抵御溫度逆境引起的氧化傷害。H202含量在8～24 h的下降也體現(xiàn)了這一點(diǎn)(圖6)。然而，隨著脅迫時間的延長，GalLDH和DHAR活性以及MDHAR和GR活性于脅迫12 h后開始下降，表明以AsA為核心的抗氧化系統(tǒng)功能逐漸降低，AsA/DHA也開始下降。同時，AsA是APX維持活性清除H20z所必需的。AsA的缺乏，使得APX的活性在12 h后也急速下降，從而導(dǎo)致H202開始積累，誘發(fā)膜脂過氧化水平加劇。羅亞等(2007)在冷處理草莓和Ma等(2008)熱處理蘋果所測定的AsA代謝相關(guān)酶活性的變化也獲得了相似的結(jié)果。