摘要：EST－SSR標記開發(fā)過程中經(jīng)常會遇到一些問題，例如引物重復設(shè)計等。本試驗對從大白菜EST序列中開發(fā)的30個多態(tài)性SSR標記產(chǎn)生的多態(tài)性條帶進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一些標記的多態(tài)性并不是由于其所含有的簡單重復序列重復次數(shù)的改變引起的，這類標記約占鑒定標記總數(shù)的13％。這些標記實際上屬于EST－SCAR標記。在進行SSR變異對基因表達及功能影響方面的研究時。這類非SSR標記應(yīng)該被排除。

關(guān)鍵詞：EST－SSR；標記開發(fā)；多態(tài)性；測序；大白菜

中圖分類號：S634.1；Q503 文獻標識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0001－04

簡單重復序列(simple sequenee Repeats，SsR8)，又稱微衛(wèi)星(microsateuite)序列，因其具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、易于操作、呈共顯性以及遍布整個基因組等特點而成為非常理想的遺傳標記。近些年來，由于許多作物的大量EST序列得以測序，這為利用EsT序列開發(fā)新的遺傳標記包括EsT－SSR提供了基礎(chǔ)。利用公共數(shù)據(jù)庫中大量的EST序列開發(fā)SSR等標記，免去了傳統(tǒng)的從基因組中開發(fā)標記時需要的克隆、測序等步驟，對開發(fā)標記而言具有省時、省力、費用低等特點。所開發(fā)出的引物由于來自于功能基因區(qū)，該區(qū)域在近緣物種中相對保守，因而具有良好的可轉(zhuǎn)移性，可以用于比較基因組學等研究。在評價作物種質(zhì)資源多樣性時，人們更希望能了解資源材料中功能基因的多樣性。來自功能基因區(qū)的EST－SSR標記，其多態(tài)性往往低于非功能基因區(qū)的genomic－SSR標記，這被認為是基因功能限制了SSR變異的結(jié)果，因而人們認為EST－SSR標記是一種功能性的遺傳標記，EST－SSR提供了良好的功能基因多樣性評價的工具。正因為EST－SSR標記具有上述特點，目前人們已經(jīng)在許多作物中開發(fā)了很多EST－SSR標記。

在實際開發(fā)EST－SSR標記的工作中常常會遇到一些問題，如引物重復設(shè)計、擴增產(chǎn)物含內(nèi)含子、引物跨越內(nèi)含子與外顯子界限、EST序列質(zhì)量低等等，這些問題可以通過適當?shù)姆椒ǖ靡越鉀Q。我們在開發(fā)大白菜EST－SSR引物過程中遇到的另一個現(xiàn)實問題是開發(fā)出的EST－SSR引物擴增出的多態(tài)性并不是由SSR位點簡單重復次數(shù)改變所引起的。這一點常常為人們所忽視，但在利用這些引物進行功能基因多樣性評價或進行SSR位點變異對基因表達及功能影響等方面的研究時，這又是客觀的不應(yīng)該忽視的問題。

1 材料與方法

1，1試驗材料及DNA提取

開發(fā)引物多態(tài)性驗證所用的材料為山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所收集保存的大白菜自交系及地方品種共8個。分別為：白引1號、白引2號、膠州白菜、掖縣豬嘴、李樓中紋、福山包頭、河頭早、黑56。

苗期采用常規(guī)的CTAB法提取各大白菜自交系及地方品種的DNA。

1.2 EST序列來源以及片段置疊群(config)構(gòu)建及引物設(shè)計

從NCBI公共數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中下載到大白菜EST序列147 217個。對這些序列參照葛佳等的方法進行前期處理，包括除去EST序列中存在的載體序列polyT(5’端)和pdyA(3’端)序列、含有歧義堿基(ambiguous bases)的序列、小于100 bp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene軟件包，DNAStar Inc.)對處理后的EST序列進行重疊群(configs)構(gòu)建。用MISA軟件(http：//WWW.pgrc.ipk－gateleben.de/misa)在構(gòu)建的重疊群中篩選SSR標記，標準參見Zhang等。對篩選到含SSR的重疊群用Primer Premier 5.0(http：//www.PremierBiosoft.com)軟件設(shè)計引物。

1.3 SSR標記多態(tài)性檢測

設(shè)計的SSR引物在上海生工合成，溶解后稀釋成2 μmol/L備用。PCR采用20μl反應(yīng)體系：40 ng模板DNA，1×PCR buffer(含20 mmol/LMgcl2)，200 μmol/L NTP8，引物0.1 μmol/L，1 uTaqDNA聚合酶。擴增程序為：95℃預變性5min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1min，共計35個循環(huán)；72℃延伸lO min。4~C 10min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)6％聚丙烯酰氨凝膠電泳后銀染檢測。

1.4 多態(tài)性條帶的回收及測序

切下凝膠板上各材料間呈多態(tài)性的條帶，置入10μl超純水中95℃加熱5 min，冷卻，短暫離心后上清液稀釋10倍進行二次PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收后用TA克隆載體(天根生化有限公司)，克隆后在諾塞基因公司測序。每個條帶各做一次重復。測序結(jié)果用MEGA4.0軟件進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST－SSR引物的設(shè)計及多態(tài)性檢測

對147 217個大白菜EST序列經(jīng)過處理和拼接后得到31 519個重疊群序列。從其中4 000個重疊群序列中發(fā)現(xiàn)了1145個SSR位點。對其中400個SSR位點設(shè)計了引物，其中230個可在大白菜8個材料中獲得清晰的擴增條帶，105個在8個材料中顯示出多態(tài)性。引物BREl44是一對多態(tài)性引物，根據(jù)重疊群contigl335設(shè)計，擴增區(qū)域含有8個二堿基Tc重復，其上游引物序列為：5’－AAACCTrrCCGTATAATGTC－3’，下游引物序列為5’－TGCTGATrCTrCTFGCTFC－3’，在大白菜8個自交系及地方品種中的擴增產(chǎn)物電泳后的結(jié)果見圖1。

2.2 多態(tài)性條帶測序結(jié)果

為了檢測多態(tài)性引物擴增的多態(tài)性條帶的大小，我們對30對多態(tài)性引物擴增的多態(tài)性條帶進行了回收，二次PCR后進行了克隆與測序。測序結(jié)果表明，所有引物擴增的均為目的片段，其大小也在目標大小范圍內(nèi)，重復間無差異。有26對引物的多態(tài)性是由SSR重復基序重復次數(shù)的改變引起的，另有4對引物(BRE48、BRE58、BREl44、BREl48)在不同材料間的多態(tài)性并不是由重復基序重復次數(shù)的改變引起的，而是由重復基序以外的堿基的插入與缺失引起的。BREl44對白引1號和河頭早的擴增條帶以及該引物所在重疊群序列的比對結(jié)果見圖2。

3 討論與結(jié)論

引物BREl44對大白菜8份材料共擴增出兩個等位變異，呈明顯的多態(tài)性(圖1)。但對多態(tài)性條帶的測序結(jié)果顯示，簡單重復序列(TC)n的重復次數(shù)在兩個等位變異中均無改變，都重復8次。但在第44～57位，河頭早明顯比白引1號多出14個堿基，在其它4個位置即第35、第8l～83、第116～117和第142～144位兩個序列間也存在堿基的插入缺失現(xiàn)象(圖2)。正是這些堿基的插入缺失突變造成了不同材料間的多態(tài)性。其它3對引物BRE48、BRE58、BREl48和BREl44情況相似，即這些引物在不同大白菜材料間擴增的多態(tài)性均是由SSR位點以外的堿基的插入缺失突變引起。這類引物大約占鑒定的30對多態(tài)性引物總數(shù)的13％。

堿基的替代、插入缺失、片斷重復是基因組進化過程中最常見的序列變異類型。EST序列來自功能基因，相對于基因組非基因區(qū)的序列，保守性較強，但并非絕對保守，尤其是在3’與5’端的非編碼區(qū)。EST－SSR標記的開發(fā)正是以EST序列中SSR變異為基礎(chǔ)的。EST序列中的其它變異例如堿基的替代、插入缺失等也常被用于開發(fā)EST－ShIP和EST－RFLP以及EST－SCAR等標記。本試驗經(jīng)過測序表明在開發(fā)EST－SSR引物的過程中，所設(shè)計的BRE48、BRE58、BRE144和BRE148四個標記的多態(tài)性并不是由SSR的變異引起，因此它們實際上是屬于EST－SCAR標記，而不是EST－SSR標記。雖然這四個標記經(jīng)測序證明不屬于SSR標記，但因其在大白菜不同品種中具有多態(tài)性，因此并不影響它們作為分子標記用于輔助育種、多樣性評價等項研究。

有實驗證據(jù)表明，EST序列中的SSR對基因的表達調(diào)控及基因的功能有著重要的影響，例如煙草花粉特異表達基因ntp303 5’－UTR區(qū)中的(GAA)s SSR位點通過形成stem－loop結(jié)構(gòu)而對mRNA的翻譯效率起著重要的調(diào)節(jié)作用，當缺失掉這8個GAA重復后，融合基因熒光素酶的表達量比對照降低了94％。有人認為EST－SSR的多樣性影響到基因的功能，有必要對呈多態(tài)性的EST－SSR的變異與基因功能的改變及對基因表達的影響之間的關(guān)系進行研究，這對闡明基因功能的進化也是非常有意義的。進行這項研究前提是要鑒定出真正存在的SSR變異，本文提到的四個標記雖然都含有SSR，但事實證明在不同材料中出現(xiàn)的變異不是由于這些SSR變異引起的。因此這四個標記顯然不適合進行這方面的研究。因此我們建議在進行EST－SSR變異對基因功能影響方面研究時對引物擴增出的多態(tài)性條帶進行測序以鑒定出真正的EST－SSR標記。