摘要：近年來(lái)煙粉虱Q型和B型在國(guó)內(nèi)外許多地區(qū)混合發(fā)生并造成危害，2種生物型的快速鑒定對(duì)于煙粉虱有效防控具有重要的指導(dǎo)意義。在前期研究基礎(chǔ)上。使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)2005～2009年山東各地采集的煙粉虱樣品(139頭Q型煙粉虱、239頭B型煙粉虱)微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM23進(jìn)行了檢測(cè)研究。結(jié)果表明，絕大多數(shù)Q型煙粉虱只擴(kuò)增到約400 bp的片段(占98.6％)，而多數(shù)B型煙粉虱擴(kuò)增到的片段約200 bp(占97.9％)。鑒于絕大多數(shù)Q型和B型煙粉虱分別只存在約400 bp和約200 bp產(chǎn)物片段。該方法可用于B型、Q型煙粉虱大量樣品生物型的初步篩選。

關(guān)鍵詞：煙粉虱；微衛(wèi)星位點(diǎn)；生物型；瓊脂糖凝膠電泳；生物入侵

中圖分類號(hào)：Q503；Q969.36+6.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942(2010)04-0004-04

煙粉虱是一種分布廣泛的重要農(nóng)業(yè)害蟲，可以傳播110多種植物病毒，對(duì)蔬菜、棉花及觀賞植物可造成嚴(yán)重危害。煙粉虱通常被視為包括許多生物型的復(fù)合種，迄今為止至少有30多個(gè)生物型。這些生物型在形態(tài)上難以區(qū)分，但在傳毒能力、寄主范圍、繁殖力、抗藥性、入侵性等方面存在差異。其中B型煙粉虱在20世紀(jì)90年代入侵到世界各地并暴發(fā)成災(zāi)，而Q型煙粉虱近5年來(lái)也從地中海周邊國(guó)家入侵到包括中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、日本在內(nèi)的至少11個(gè)國(guó)家。煙粉虱在山東省分布廣泛，特別是在抗蟲棉上種群數(shù)量高于常規(guī)棉，對(duì)抗蟲棉生產(chǎn)形成威脅。近期研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)許多地區(qū)Q型與B型混合發(fā)生并成為煙粉虱的優(yōu)勢(shì)生物型。Q型煙粉虱對(duì)常用的新煙堿類、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑具有明顯抗性，而這些殺蟲劑能很好控制B型煙粉虱，因此，這兩種生物型的快速鑒別對(duì)于煙粉虱有效防控具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)煙粉虱生物型的鑒定通常使用各種分子標(biāo)記，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPDPCR)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(mt COI)、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)I(ITSI)等。近年來(lái)，許多研究人員開發(fā)了能夠快速鑒別煙粉虱B型、Q型的分子標(biāo)記，如序列特征擴(kuò)增區(qū)(SCAR)和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS，又稱為PCR－RFLP)分子標(biāo)記。

MeKenzie等(2009)L20J研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM06和BEM23聯(lián)合使用能準(zhǔn)確鑒定美國(guó)煙粉虱生物型。BEN06目的片段均在200 bp左右，而BEM23的目的片段在B型與Q型煙粉虱之間差異較大，B型只有224 bp的片段，而絕大多數(shù)Q型煙粉虱(99％Q1線粒體型、100％Q2線粒體型和95％Q3線粒體型)擴(kuò)增得到407 bp或410 bp片段，只有1％Q1線粒體型有224 bp、5％Q3線粒體型有230 bp片段。我們進(jìn)一步驗(yàn)證也表明：在微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM23，Q型煙粉虱具有不同于B型煙粉虱的等位基因。

微衛(wèi)星分析通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)，操作相對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳較為煩瑣，而B型、Q型煙粉虱在BEN23位點(diǎn)存在的特異片段(之間相差約180 bp)可以利用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)，而且可以明顯區(qū)分，檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便。鑒于當(dāng)前許多地區(qū)Q型煙粉虱占據(jù)主體，那么是否可以利用多數(shù)Q型煙粉虱個(gè)體在BEM23位點(diǎn)約400 bp片段的特點(diǎn)來(lái)對(duì)大量煙粉虱樣品進(jìn)行初步篩選，然后對(duì)約200 bp片段個(gè)體進(jìn)行進(jìn)一步生物型鑒別?基于上述思路，我們對(duì)大量的B型與Q型煙粉虱微衛(wèi)星BEM23位點(diǎn)進(jìn)行了檢驗(yàn)，以期對(duì)煙粉虱生物型的快速鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2005～2009年山東各地采集的煙粉虱樣品，浸泡在95％酒精中，于－20℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)共使用煙粉虱樣品378頭，參考Khastan等和Ueda的方法利用Vsp I與Stu I為基礎(chǔ)的mtCOI－CAPS鑒定生物型，共139個(gè)Q型個(gè)體和239個(gè)B型個(gè)體(表1)。

1.2 微衛(wèi)星BEM23位點(diǎn)擴(kuò)增與檢測(cè)

單頭煙粉虱DNA的提取方法參照褚棟等的方法，最后加雙蒸水定容至50μl。PCR反應(yīng)體系包括：2μl反應(yīng)緩沖液，1 U Taq酶，0.2 mmol/LdNTPs，BEM23上下游引物各0.2 panol/L，模板DNA為4μl。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，條件為94℃預(yù)變性2 min；然后94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸5min。反應(yīng)完成后取5μl產(chǎn)物用1％瓊脂糖檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

微衛(wèi)星引物BEM23能對(duì)煙粉虱樣品進(jìn)行有效擴(kuò)增(見(jiàn)圖1)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，均可得到約400bp或約200 bp的片段(見(jiàn)表2)。絕大多數(shù)Q型煙粉虱只擴(kuò)增到約400 bp的片段(占98.6％)，而多數(shù)B型煙粉虱擴(kuò)增到的片段約200 bp(占97.9％)。0.7％的Q型煙粉虱可以擴(kuò)增到約200bp的片段，0.4％的B型可以擴(kuò)增到約400 bp的片段。另外，還有少部分的B型與Q型煙粉虱同時(shí)擴(kuò)增到2條片段。

3 討論與結(jié)論

尋找一個(gè)簡(jiǎn)便的適用于大量煙粉虱樣品生物型鑒定的方法對(duì)于煙粉虱防治及入侵生態(tài)學(xué)研究都有重要的意義。鑒于煙粉虱Q型與B型的較強(qiáng)入侵性及危害性，各國(guó)研究者開發(fā)了許多鑒別這2種生物型的快速分子標(biāo)記。然而，這些分子標(biāo)記由于世界各國(guó)2種生物型核基因或線粒體基因的遺傳變異，其有效性及使用范圍有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有易于檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，如果可以使用一種微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)區(qū)分B、Q型煙粉虱則生物型鑒定將變得更加容易。根據(jù)McKenzie等(2009)[20l的研究結(jié)果，利用微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM23可以初步將多數(shù)Q型個(gè)體從B型、Q型煙粉虱混合種群中鑒別出來(lái)。本研究中，139個(gè)Q型煙粉虱樣品中，有137個(gè)在微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM23處只出現(xiàn)約400 bp的片段，這與McKenzie等(2009)的研究結(jié)果一致。但是與之不同的是，239個(gè)B型煙粉虱中也有1個(gè)B型煙粉虱個(gè)體也能擴(kuò)增出約400 bp片段(僅擴(kuò)增到約200 bp片段的有234個(gè)個(gè)體)。而且，少數(shù)B型、Q型煙粉虱在BEM23位點(diǎn)還可以擴(kuò)增到約400 bp和約200 bp2條較弱目的片段。這可能與采集樣品不同有關(guān)，也可能是生物型間遺傳變異或生物型間雜交所導(dǎo)致的。

在田間調(diào)查或進(jìn)行煙粉虱生物型監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)等不需要精確數(shù)值的工作方面，微衛(wèi)星標(biāo)記方法比現(xiàn)有的其他方法顯示出較大優(yōu)勢(shì)，例如費(fèi)用少，方法簡(jiǎn)單，易于操作，易于檢測(cè)，只需要瓊脂糖檢測(cè)即可。而且，B型煙粉虱出現(xiàn)約400 bp的幾率很低，15個(gè)種群239頭B型煙粉虱中只有1個(gè)特殊個(gè)體。樣品只擴(kuò)增出約400 bp的情況下，99.3％(137/138)的個(gè)體是Q型煙粉虱，而B型的比例為0.7％。若只擴(kuò)增約200 bp，則樣品為B型的可能性是99.6％。在實(shí)踐中，可以利用該方法初步鑒定生物型，然后再對(duì)特殊個(gè)體(出現(xiàn)2條帶的)用其他方法進(jìn)行鑒定(如CAPS)，這樣會(huì)減少工作量或降低費(fèi)用。同時(shí)，利用該方法鑒定生物型對(duì)DNA質(zhì)量要求較低，我們實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)用C1－J－2195/L2－N－3014擴(kuò)增CO I失敗的情況下，可以用BEM23擴(kuò)增從而鑒別B型與Q型煙粉虱。因此，應(yīng)用微衛(wèi)星位點(diǎn)BEM23在大批量篩選監(jiān)測(cè)煙粉虱生物型動(dòng)態(tài)以及室內(nèi)研究生物型競(jìng)爭(zhēng)取代等方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值。