摘要：利用3年生黑松苗作接種材料，分別接種消毒后的松材線蟲(chóng)和從線蟲(chóng)體內(nèi)分離得到的細(xì)菌分離物以及線蟲(chóng)與細(xì)菌兩者的混合物，調(diào)查比較發(fā)病情況。結(jié)果表明，單獨(dú)接種消毒后的細(xì)菌分離物，松樹(shù)不萎蔫，單獨(dú)接種松材線蟲(chóng)松樹(shù)發(fā)病枯死，而接種松材線蟲(chóng)和細(xì)菌分離物兩者的混合物，松樹(shù)發(fā)病更為嚴(yán)重。由此說(shuō)明松材線蟲(chóng)的伴生細(xì)菌對(duì)松樹(shù)萎蔫病的發(fā)生有一定作用，但并不是導(dǎo)致松樹(shù)發(fā)病枯死的決定因素。

關(guān)鍵詞：黑松；松材線蟲(chóng)；伴生細(xì)菌；松樹(shù)萎蔫病

中圖分類號(hào)：S763.712.56 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001－4942(2010)04－0059－03

松樹(shù)萎蔫病又稱松材線蟲(chóng)病，是松樹(shù)的一種毀滅性傳染病，對(duì)我國(guó)松林資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破懷。本試驗(yàn)以3年生黑松為接種材料，以2個(gè)地理種即浙江松材線蟲(chóng)Bxzh和葡萄牙松材線蟲(chóng)Bxpo以及分離獲得的兩個(gè)細(xì)菌分離物Bzh和Bpo為材料，通過(guò)接種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步研究，以期明確松材線蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌和松樹(shù)萎蔫病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樹(shù)種為3年生黑松(Pinwus thunbergii)。

供試松材線蟲(chóng)為浙江松材線蟲(chóng)Bxzh和葡萄牙松材線蟲(chóng)Bxpo，分別來(lái)自浙江和葡萄牙。采用單異活體培養(yǎng)法將消毒的線蟲(chóng)接種于生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基上的灰葡萄孢(Bort，yis cinerea)上25℃培養(yǎng)繁殖。接種前，線蟲(chóng)先經(jīng)0.5％硫柳汞消毒15～20 min，再經(jīng)0.5％硫酸鏈霉素消毒15～20 min，最后用無(wú)菌水洗3次，移入Eppendorf管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試細(xì)菌，將含有少量松材線蟲(chóng)的水懸液經(jīng)0.1％硫酸鏈霉素消毒15～20 min，無(wú)菌水洗3次后，于NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏0.5％，K2HPO40.5％，瓊脂1.5％，pH值為7.0)上25℃下倒置培養(yǎng)。1～2 d后，將長(zhǎng)出細(xì)菌的培養(yǎng)基放于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行純化，從浙江松材線蟲(chóng)Bxzh和葡萄牙松材線蟲(chóng)Bxpo中分別得到細(xì)菌分離物Bzh和Bpo，將其加入到NB培養(yǎng)基(NA中不加瓊脂)中。27℃、170 r/rain振蕩條件下暗培養(yǎng)2 d，平板稀釋計(jì)數(shù)后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 接種

采用皮接法。用鋒利的刀片在黑松苗基部離地面約5 em處斜切一深達(dá)木質(zhì)部的傷口，然后塞入一塊脫脂棉，并用膠布纏緊，上端留一縫隙以便接種。共設(shè)9個(gè)處理：①線蟲(chóng)：接種消毒后的浙江線蟲(chóng)Bxzh和葡萄牙線蟲(chóng)Bxpo，均為5 000條/株。②細(xì)菌：接種細(xì)菌分離物Bzh和Bpo，均為3×10CFU/株。③線蟲(chóng)+細(xì)菌：每株接種消毒后的松材線蟲(chóng)5 000條及其對(duì)應(yīng)的細(xì)菌分離物3×10CFU。④陽(yáng)性對(duì)照：接種未消毒的線蟲(chóng)，均為5 000條/株。⑤無(wú)菌水陰性對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.3 病情觀察

從接種后開(kāi)始觀察，記載松樹(shù)發(fā)病情況。每隔5 d觀察1次，記錄發(fā)病級(jí)數(shù)。松苗的病情分級(jí)和感病指數(shù)的計(jì)算按談家金等(2000)的方法進(jìn)行。樹(shù)苗死后，去掉樹(shù)皮和針葉，分離收集線蟲(chóng)計(jì)數(shù)并采用Brassh等(1999)提出的方法計(jì)算相關(guān)寄主適應(yīng)性(Relative Host Suitability，RHS)系數(shù)。

發(fā)病級(jí)數(shù)，根據(jù)針葉褪綠枯黃和變紅的程度分為5級(jí)。0級(jí)為針葉正常；I級(jí)為部分褪綠1/4針葉變黃；Ⅱ級(jí)為2/4～3/4針葉變黃、1/4以下針葉變紅；III級(jí)為3/4左右針葉變紅；IV級(jí)為針葉全變紅瀕臨死亡或死亡。

感病指數(shù)(IP)=∑(發(fā)病株數(shù)×代表級(jí)數(shù))/(處理株數(shù)×最高病級(jí)代表值)

RHS系數(shù)=(接種后松苗死亡百分?jǐn)?shù)×每株死亡松苗分離線蟲(chóng)的平均數(shù))/1000

2 結(jié)果與分析

2.1 感病進(jìn)程分析

由表1看出，單獨(dú)接種細(xì)菌分離物Bzh、Bpo及無(wú)菌水對(duì)照在不同接種時(shí)期不發(fā)病或發(fā)病較輕；除個(gè)別時(shí)期外，Bxzh、Bxzh+Bzh、Bxzh CK+3個(gè)處理在相同時(shí)期發(fā)病逐漸加重，同處理隨接種時(shí)間延長(zhǎng)其發(fā)病總體呈愈加嚴(yán)重趨勢(shì)。Bxpo、Bx－p0+Bpo、Bpo CK+3個(gè)處理的發(fā)病規(guī)律同上。

2.2 接種后的黑松樹(shù)苗死亡率

由表2可知，接種葡萄牙線蟲(chóng)分離細(xì)菌、浙江線蟲(chóng)分離細(xì)菌和無(wú)菌水的處理，松樹(shù)未死亡，而線蟲(chóng)分離其它處理的松枝全部死亡。可以推斷，單獨(dú)接種細(xì)菌不能使黑松樹(shù)苗致死，只有接種了松材線蟲(chóng)或者同時(shí)接種了線蟲(chóng)+細(xì)菌才能導(dǎo)致黑松樹(shù)苗萎蔫枯死。

2.3 各處理的RHS系數(shù)

由表3可知，分離葡萄牙線蟲(chóng)的RHS系數(shù)，處理Bxzh CK+>Bxzh+Bzh>Bxzh；分離浙江線蟲(chóng)的RHS系數(shù)變化趨勢(shì)同葡萄牙線蟲(chóng)；處理Bzh、Bpo、CK一未分離得到線蟲(chóng)，RHS系數(shù)為0。RHS系數(shù)可以顯示黑松對(duì)不同線蟲(chóng)群體的適應(yīng)能力，也可顯示不同群體的致病力?？芍魈幚淼腞HS系數(shù)越大，該處理的致病力也越強(qiáng)。

3 小結(jié)與討論

綜上所述，由致死率知，單獨(dú)接種松材線蟲(chóng)的伴生細(xì)菌不能使黑松枯萎死亡，而單獨(dú)接種線蟲(chóng)或同時(shí)接種線蟲(chóng)及其伴生細(xì)菌的混合物可導(dǎo)致黑松發(fā)病致死；由感病指數(shù)和RHs系數(shù)知，伴生細(xì)菌可加重黑松感病，這一點(diǎn)與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道有所不同。

可見(jiàn)，松材線蟲(chóng)本身對(duì)松樹(shù)的萎蔫起到極其重要的作用，不僅是其伴生菌的載體，其在樹(shù)體中的繁殖移動(dòng)很可能對(duì)樹(shù)體造成了破壞，從而導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)下降。如果在此時(shí)遇到高溫干旱等逆境脅迫，松樹(shù)死亡會(huì)更高。

用無(wú)菌線蟲(chóng)接種的松苗發(fā)病速率明顯減慢。最終分離到的線蟲(chóng)數(shù)少于原接種量。對(duì)這一現(xiàn)象的可能解釋是：(1)松材線蟲(chóng)的所謂伴生細(xì)菌在線蟲(chóng)的生活力上有極其重要的作用；(2)在消毒過(guò)程中，鏈霉素或硫柳汞對(duì)線蟲(chóng)的生活力造成了一定的影響，從而使得線蟲(chóng)的繁殖力下降。

伴生細(xì)菌使感病加重，也同樣證明了伴生細(xì)菌對(duì)松材線蟲(chóng)為害的促進(jìn)作用，其原因還有待于進(jìn)一步研究。單獨(dú)接種伴生細(xì)菌并不能使松樹(shù)萎蔫枯死，也說(shuō)明伴生細(xì)菌并不是導(dǎo)致松樹(shù)發(fā)病枯死的決定因素。