徐秀珍

（天津薊縣產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，天津 301900）

高效液相色譜是以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，它是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。它所用的固定向粒度小(5-10um)，有傳質(zhì)快、柱效高等特點。高效液相色譜法(HPLC)是60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來,在保健食品功效成分、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等方面應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測定。高效液相色譜儀是由輸液系統(tǒng)(包括貯液器、高壓泵等)、分離系統(tǒng)(包括進(jìn)樣器、色譜柱等)、檢測系統(tǒng)(包括檢測等)、收集系統(tǒng)(包括餾分收集器、自動收集裝置等)等組成。這些系統(tǒng)就象人的脈絡(luò)一樣相互依賴,每個環(huán)節(jié)的故障都會影響到分析測試結(jié)果的可靠性、真實性。因此,對液相色譜進(jìn)行故障排查及作好日常維護(hù)保養(yǎng)是延長色譜使用壽命的關(guān)鍵。下面就輸液泵、檢測器的常見故障及其使用與維護(hù)進(jìn)行分析。

1 輸液泵的常見故障及使用與維護(hù)

輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件。目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵。主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個單項閥組成，用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運動。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。

1.1 單向閥故障

由于球與閥座密封不嚴(yán)，導(dǎo)致液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。為避免單項閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45um濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用25ml水＋25ml甲醇＋25ml異丙醇＋25ml二氯甲烷依次沖洗，最后再用所用的溶液沖洗整個系統(tǒng)。注意：沖洗時應(yīng)打開泄液閥。如果氣泡進(jìn)入閥中，它會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起液體倒流，導(dǎo)致泵的壓力和流速明顯改變。此時應(yīng)立即打開瀉液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。如果泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，具體做法為：用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵進(jìn)液，這時可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊。如果采取上述方法仍不能使壓力穩(wěn)定,應(yīng)考慮是密封墊圈壞了?或單向閥磨損、球不光滑等,需更換部件。

1.2 泵墊圈故障

泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng).液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，樣品PH值一般調(diào)到中性，才可進(jìn)樣。如果強(qiáng)酸強(qiáng)堿會損壞密封墊和柱塞桿。密封圈與運動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運動而流動相不漏出來,它是液相色譜中最易磨損的部件。有條件的實驗室可三個月更換一次墊圈,以防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時沖洗。墊圈損壞一般表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。為避免上述故障的發(fā)生,我們在分析中應(yīng)注意以下幾點:①使用超純水、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相；②配好的流動相一定要抽濾脫氣,即便儀器有在線脫氣裝置,也最好在上機(jī)前進(jìn)行抽濾；③泵在啟動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣；④用緩沖鹽洗脫時,分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個流路系統(tǒng),最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。

2 檢測器的常見故障及對策

液相色譜儀常用的檢測器主要有紫外、熒光和電化學(xué)檢測器三種。這些檢測器的作用就是收集流經(jīng)色譜分離柱的各組分在檢測器中的信號,根據(jù)組份分光吸收值/熒光強(qiáng)度/電極表面電流的變化計算出組分的濃度。

檢測器常見故障及對策主要有：

2.1 基線噪音較大及對策

對于紫外檢測器，氘燈光源打開后要預(yù)熱30分鐘以上，基線才能穩(wěn)定。氘燈用的過久，接近壽命期時(氘燈的壽命約為1000小時)，會使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時更換氘燈。除光源外，流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。那么，怎樣判斷基線噪音增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡呢?首先，可將泵關(guān)閉繼續(xù)走基線，如果噪音立即停止,基線呈一條直線,說明基線噪音來自流動相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣。其次，如果停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極對氣泡十分敏感，儀器的平衡時間較長，流路中如果有氣泡存在，不僅基線會出現(xiàn)尖峰，還會影響檢測。因此，做電化學(xué)檢測時，流動相的配制要很嚴(yán)格。水要超純、除還原物外配好后一定要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是YK材料，即電化學(xué)分析專用儀器，而是普通的高效液相色譜不銹鋼泵，在分析前應(yīng)對系統(tǒng)中的輸液泵、進(jìn)樣器和管道用6moUL硝酸溶液鈍化（注意斷開分離柱）或在流動相中加入EDTA離子隱蔽劑可縮短基線平衡時間。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中，光靠泵沖有時太慢，可暫時將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表面，但 對液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸。

2.2 檢測器污染及對策

管道污染阻塞是檢測器常見故障。當(dāng)流動相用了緩沖鹽更換流動相不當(dāng)時，常會使檢測器管路中產(chǎn)生沉淀，可先用5倍柱體積的非緩沖液反向流動相沖洗系統(tǒng)，再用10倍柱體積的強(qiáng)溶劑（如乙腈）流過，然后用50倍的柱體積的異丙醇沖洗，最后換上反向流動相平衡。

檢測器管路堵塞，一般表現(xiàn)為柱壓升高。此時，可斷開柱子，直接接檢測器。如泵壓仍較高，可斷定壓力升高是由于檢測器管道堵塞造成。檢測器進(jìn)口是常發(fā)生阻塞的地方，正向沖洗效果常不明顯。我們的經(jīng)驗是將檢測器進(jìn)出口對調(diào)，用6moUL硝酸溶液反沖檢測器，這樣能很快將阻塞沖開，但要注意用低流速沖洗，觀察壓力變化。

2.3 池阻塞和污染及對策

檢測池阻塞和污染多見紫外檢測器。通常，池阻塞的故障比較少見，而池污染常發(fā)生。當(dāng)池受污染時，一般表現(xiàn)為基線噪音增大，儀器靈敏度下降。此時，應(yīng)對池進(jìn)行清洗。清洗程序如下：①回抽10ml異丙醇去掉流動相殘留；②回抽10ml蒸餾水；③回抽10mL 6mol/L硝酸,通過池去掉沉積物,此步應(yīng)十分小心,備有防止應(yīng)急措施；④回抽20ml蒸餾水；⑤至少用100mlHPLC級的水正向通過池。為了減少危險和麻煩,清洗更充分,可采用下列步驟:①拆開柱,在檢測器出口處接一根細(xì)徑的聚乙烯管,約50cm長；②推高試劑瓶,使水平線高于池約40cm,聚乙烯管另一端沒入清洗液中,在檢測器進(jìn)口處用洗耳球吸液,然后利用重力使清洗液自然流經(jīng)池；③沖洗溶液順序為50ml無水乙醇→50ml蒸餾水→250ml 3mol/L硫酸→100ml蒸餾水。用此法沖洗不需要拆開池,無損于管路,但流速較慢。對于電化學(xué)檢測器，要注意維護(hù)工作電極表面的清潔度。當(dāng)檢測器檢測了大量較臟的樣品(如血漿、尿液)或用的過久，應(yīng)用化學(xué)法或物理拋光法對電極表面進(jìn)行清潔，這樣可提高一定的檢測靈敏度。但要特別注意：最后一定要用純水沖洗干凈，不要帶來其他污染。

高效液相色譜儀是現(xiàn)代科學(xué)研究中廣泛使用的分析儀器，只有正確的使用與維護(hù),才能更好的駕馭它,讓HPLC技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

[1]楊祖英主編.食品檢驗.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000.