劉 輝，馮常輝

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件初探

劉 輝，馮常輝

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

采用黑曲霉(Aspergillusniger)液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，研究了碳源、氮源、培養(yǎng)基起始pH對該菌株產(chǎn)纖維素酶活力的影響。結(jié)果表明，在溫度30 ℃、pH5.5下培養(yǎng)120 h的條件下確立了產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基是6%的稻草粉、1%的黃豆粉,其纖維素酶的最高產(chǎn)量是89.2 U/mL。

黑曲霉(Aspergillusniger)；纖維素酶；液態(tài)發(fā)酵

隨著全世界能源危機、糧食危機、環(huán)境污染等問題的日趨嚴重,纖維素酶的研究和開發(fā)利用再次成為人們關(guān)注的熱點。纖維素酶的應(yīng)用已從傳統(tǒng)的醫(yī)藥、食品深加工、飼料[1]、飲料、酒、醬油和食醋釀造等行業(yè),擴展到單細胞發(fā)酵、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境污染治理等新領(lǐng)域[2]。然而,目前纖維素酶生產(chǎn)的菌株,絕大多數(shù)集中于木霉,而木霉的發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種毒素,纖維素酶系仍欠齊全[3],致使纖維素酶的應(yīng)用受到限制。人們應(yīng)用激光誘變技術(shù)[4],篩選到一系列有生產(chǎn)潛力的黑曲霉菌株,綜合測定表明其中有些菌株比較理想，能產(chǎn)生纖維素酶。本研究對黑曲霉發(fā)酵的產(chǎn)酶條件和最適作用條件進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 菌種 黑曲霉3275，由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室優(yōu)化選種。

(2)培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%、麩皮1%、(NH4)2SO40.15%、pH5.5～6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草粉6%、黃豆粉1%、KH2PO40.45%、CaCl20.25%、pH5.5～6.0。

1.2 方法

(1)纖維素酶液體深層發(fā)酵 將新鮮的斜面菌種的孢子接入種子培養(yǎng)基。30 ℃、搖床上培養(yǎng)48 h后，按10%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，搖床150 r/min，30 ℃下培養(yǎng)120 h停止發(fā)酵。

(2) 酶活力的測定 羧甲基纖維素酶(CMCase)的活力測定：DNS法[5]。取0.5 mL稀釋了25倍的酶液，加入0.5%的CMC溶液2.5 mL，在50 ℃下酶解反應(yīng)0.5 h，加入6 mL DNS試劑。然后沸水浴10 min，顯色測出還原糖量。對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶活力，酶活力單位定義為1 h水解生成1 mg葡萄糖的酶量為1個活力單位。

(3)pH對菌株生長影響的測定 在溫度30 ℃下, 以pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5條件下測定酶活力D260值。

(4)最佳培養(yǎng)基材料的測定 在溫度30 ℃和最佳pH條件下，碳源的濃度定為6%，以稻草粉、米糠、麩皮、甘蔗渣為原料進行優(yōu)化選擇；氮源濃度定為1%，以(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl、蛋白胨、黃豆粉、酵母膏和NH4NO3進行優(yōu)化選擇。

(5)培養(yǎng)基正交實驗 根據(jù)預(yù)備實驗，設(shè)計2因子4水平的正交試驗(表1)，在溫度30 ℃下進行培養(yǎng)基的正交實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖溶液濃度y=1.462 8x+0.046 9。式中，y代表相當(dāng)葡萄糖量,mg/mL；x代表酶解反應(yīng)產(chǎn)物溶液經(jīng)顯色后所測的光密度值。酶活力計算公式為CMCase =(y/25)×9×25×(1/0.5)×(1/0.5)。

2.2 培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響

圖1 培養(yǎng)基起始pH對酶活力的影響Figure 1 Effect of the original pH on CMCase activity

圖2 碳源對產(chǎn)酶活力的影響Figure 2 Effect of the carbon material on CMCase activity

研究不同起始pH對此株黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的影響，pH的調(diào)節(jié)用0.1 mol/L鹽酸或0.1 mol/L NaOH。結(jié)果見圖1。圖1表明，該菌株在pH5.5～6.0時產(chǎn)生的酶活力高而且酶活穩(wěn)定。若初始pH低于5.5時，酶活明顯降低，當(dāng)pH高于6.0時，CMCase酶活呈下降趨勢。

2.3 碳源對產(chǎn)酶活力的影響

纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶[6]，不同的碳源對纖維素酶的合成具有顯著的影響，因此試驗了一系列碳源對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，此時碳源的濃度定為6%，用1%黃豆粉作氮源，結(jié)果見圖2。由圖2可知，以稻草粉為碳源時CMCase最高，以麩皮、米糠、甘蔗渣為碳源時酶活力稍微低些。因此選用稻草粉為碳源進行發(fā)酵實驗。

2.4 氮源對產(chǎn)酶活力的影響

用7種不同的氮源進行發(fā)酵試驗，此時氮源濃度定為1%，用6%稻草粉作碳源，酶活測定結(jié)果見圖3。結(jié)果表明不同氮源產(chǎn)酶活力大小順序是黃豆粉、酵母膏、蛋白胨、無機氮源。使用無機氮源時，生長情況較差，酶活較低。當(dāng)用黃豆粉作氮源時，對菌株生長和產(chǎn)酶都有促進。

圖3 氮源對產(chǎn)酶活力的影響Figure 3 Effect of the nitrogen material on CMCase activity

2.5 培養(yǎng)基氮碳源用量對酶活力的影響

用稻草粉為碳源、黃豆粉為氮源的二級發(fā)酵試驗中，稻草粉、黃豆粉不同比例組合對纖維素酶活性影響較大(表1)。當(dāng)?shù)静莘蹫?%、黃豆粉為1%時，MCase酶活最高。因此本實驗用6%稻草粉、1%黃豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基。實驗中發(fā)現(xiàn)無機鹽以KH2PO4和CaCl2的用量對酶活性影響較大。有關(guān)文獻報道[8]KH2PO4用量是0.45時，CaCl2是0.25時生長狀況良好。

表1 正交試驗結(jié)果Table 1 The results of or thogonal experiment

3 結(jié)論

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，培養(yǎng)基中纖維素的含量直接影響纖維素酶的產(chǎn)生，因此本實驗對其碳源作了大量摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維性碳源稻草粉、麩皮、玉米芯粉、玉米秸稈都是較好的碳源，與已報道的研究結(jié)果一致[7]，可溶性碳源葡萄糖和纖維二糖也是較好的碳源，但總的來說纖維性碳源比可溶性碳源要好一些[8]。由于稻草粉含有豐富的纖維素，價格便宜且來源廣泛，并且通過實驗表明稻草粉是生產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基良好的碳源。

用稻草粉作碳源時，由于稻草粉比容較大，因此難以進行高濃度發(fā)酵。對黑曲霉進行的液體發(fā)酵條件的研究結(jié)果表明：以6%的稻草粉、1%的黃豆粉，pH保持5.5～6.0，配以0.45%的KH2PO4和0.25%的CaCl2無機鹽作為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，可以得到較高的纖維素酶活性。利用上述培養(yǎng)液，在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)120 h產(chǎn)酶活性最高，CMCase活性是89.2 U/mL。

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2008-11-04

劉 輝(1977-)，男，湖北武漢人，理學(xué)碩士，講師，現(xiàn)從事分子生物學(xué)研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.016

TQ920.1

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1673-1409(2009)03-S050-03