杲修杰，劉曉華，錢令嘉

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津 300050)

脂蛋白相關磷脂酶A2表達載體的構建

杲修杰，劉曉華，錢令嘉

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津 300050)

為構建大鼠脂蛋白相關磷脂酶A2(LP-PLA2)原核表達載體，采用PCR方法擴增得到了大鼠LP-PLA2基因全長序列，構建了pGEX-4T-1-rLP-PLA2重組質粒。將該質粒進行DNA序列測定，結果與LP-PLA2序列一致。成功構建的LP-PLA2的原核表達載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2可用于LP-PLA2的功能研究，為研究LP-PLA2在細胞中的功能奠定了基礎。

動脈粥樣硬化；LP-PLA2；pGEX-4T-1；載體構建

近年來，在對動脈粥樣硬化病因機制的探尋中，眾多研究結果顯示脂蛋白相關磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2)與動脈粥樣硬化具有相關性，LP-PLA2可能作為一種炎癥反應標志物，在動脈粥樣硬化的啟動和發(fā)展中起關鍵作用[1～3]。為了更為深入地研究血漿LP-PLA2在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用和生物學意義，本研究通過PCR技術擴增LP-PLA2基因并成功構建了LP-PLA2的原核表達載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2，為LP-PLA2的功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pGEX-4T-1質粒購自GE公司；BamH I 、XhoI、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、DNA分子量標準DL2000購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2×pfu PCR MasterMix、E.coliDH5α菌株購自北京天為時代公司產品；其余均為國產分析純試劑。核酸電泳單元及附件為Bio-Rad公司產品；PCR儀購自PE公司。

1.2 重組質粒的構建

(1) LP-PLA2基因片段的擴增及回收 根據(jù)Genbank所查到的LP-PLA2基因設計擴增引物，并由博亞生物公司合成。上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGCCGCTCAAACTGC-3’(插入BamH I酶切位點)。下游引物：5’-CCGCTCGAGCTAATTCTGGTTGTGTGAT-3’(插入XhoI酶切位點)。大鼠肝臟組織用Trizol法提取RNA，逆轉錄獲得cDNA作為PCR的模板。PCR反應條件：94 ℃預處理5 min, 94 ℃變性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 30個循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。PCR產物回收：PCR產物15 μL/孔進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切除含目的DNA片段的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

(2)質粒和目的DNA基因片段的酶切 在1 mL Ependorf管中加入下列反應體系：1 μLBamH I,1 μL XhoI,2 μL 10×buffer, 10 μLLP-PLA2基因片段，6 μL 去離子水。放入37 ℃水浴中1 h以上，置于4 ℃冰箱中備用。

(3)DNA片段回收 酶切產物15 μL/孔進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切下所需的DNA片段，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA片段，并放入-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)連接反應 在1 mL Ependorf管中加入下列反應體系：1 μL T4-DNA連接酶,2.5 μL T4-DNA連接酶 10×Buffer,1 μL載體DNA, 1.5 μLLP-PLA2基因片段，19 μL 去離子水。放入16 ℃水浴中10 h以上，置于4 ℃冰箱中備用。

(5)轉化反應 將裝有感受態(tài)細菌的Ependorf管置于冰上融化。取10 μL目的DNA加入到100 μLE.coliDH5α感受態(tài)細菌中，輕輕旋轉以混勻內容物，冰浴放置30 min。將Ependorf管放于42 ℃水浴中90 s后，轉移到冰浴中，冷卻3 min。加入500 μL液體LB培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床振搖培養(yǎng)，溫育45 min使細菌復蘇。取100 μL已轉化的感受態(tài)細菌轉移到含相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃板，置于室溫直至液體被吸收。倒置平板，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑選單一的菌落擴增培養(yǎng)。

(6)酶切鑒定 用質粒提取試劑盒提取質粒，將質粒送到博亞公司鑒定。

2 實驗結果

2.1 構建載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2

脂蛋白相關磷脂酶A2基因編碼序列全長為1 323 bp。以大鼠cDNA為模板，采用PCR方法擴增脂蛋白相關磷脂酶A2基因全長序列，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，在 1 000～2 000 bp處有1條明亮條帶(圖1)。

將脂蛋白相關磷脂酶A2基因PCR產物和pGEX-4T-1質粒經(jīng)過BamH I/XhoI酶切、連接、轉化、篩選后，獲得pGEX-4T-1-rLP-PLA2質粒。將此質粒用BamH I/XhoI酶切，凝膠電泳可見2條清晰的條帶，從大小上分別與pGEX-4T-1載體片段和脂蛋白相關磷脂酶A2編碼基因序列長度一致(圖2)。

圖1 LP?PLA2基因PCR擴增結果Figure1 PCRresultsofLP?PLA2gene圖2 pGEX?4T?1?rLP?PLA2質粒酶切結果Figure2 DoublerestrictionenzymedigestofpGEX?4T?1?rLP?PLA2plasmid

將此質粒送至博亞公司測序，測序結果如圖3所示。經(jīng)NCBI Blast比較，該序列與NM_005084脂蛋白相關磷脂酶A2蛋白的cDNA編碼序列完全一致，表明載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2構建成功。

圖3 pGEX-4T-1-rLP-PLA2質粒測序結果Figure 3 Results of sequencing pGEX-4T-1-rLP-PLA2 plasmid

3 討論

近年來的多項國際研究結果確認了血漿水平與心血管疾病相關性，LP-PLA2水平對心血管細胞生物學效應的研究正引起越來越多的關注[4～7]。研究發(fā)現(xiàn)LP-PLA2能夠引起內皮功能障礙，啟動和促進多種炎性反應，從而導致動脈粥樣硬化的形成[8]。血漿LP-PLA2參與了心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理機制，血漿中LP-PLA2水平的變化可能標志著心血管疾病的病程[4]。本實驗以大鼠cDNA為模板，通過PCR的方法得到了脂蛋白相關磷脂酶A2的基因序列，并將其與pGEX-4T-1質粒進行酶切和連接，得到了pGEX-4T-1- rLP-PLA2載體，經(jīng)酶切和測序鑒定，所得到的載體即為我們所需要的pGEX-4T-1-rLP-PLA2載體。該載體的構建為LP-PLA2的功能研究提供了很好的保證，為以后研究LP-PLA2在多種疾病的病理過程中發(fā)揮的生物學作用及其分子基礎提供了實驗基礎。

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2009-03-20

天津市應用基礎研究計劃面上項目(07JCYBJC08900)

杲修杰(1980-) ,男,山東濰坊人，理學碩士，研究實習員，主要從事應激醫(yī)學研究.

錢令嘉, newjia@vip.sina. com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.012

Q782

A

1673-1409(2009)03-S039-03