趙嚴(yán) 程禮 王興鵬 王宇輝 劉國慶

·論著·

脂蛋白脂酶基因缺陷小鼠急性胰腺炎的研究

趙嚴(yán) 程禮 王興鵬 王宇輝 劉國慶

目的探討應(yīng)用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的雜合子小鼠作為制備高脂血癥相關(guān)性急性胰腺炎的動物模型的可行性。方法野生型及LPL雜合子小鼠均分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組又分為12、24 h 2個時點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg體重)7次，每次間隔1 h。對照組同法注射等量生理鹽水。檢測各組小鼠血漿三酰甘油(TG)、淀粉酶水平，觀察胰腺形態(tài)學(xué)改變并評分。結(jié)果LPL雜合子小鼠對照組血TG為(3.55±0.27)mmol/L，顯著高于野生型小鼠對照組的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。雜合子小鼠實(shí)驗(yàn)組12 h的血TG、淀粉酶水平分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3685±484)U/L，均顯著高于野生型小鼠實(shí)驗(yàn)組12 h的(0.92±0.11)mmol/L和(2501±410)U/L(Plt;0.05)。雜合子小鼠實(shí)驗(yàn)組12 h的胰腺水腫、壞死、出血和炎細(xì)胞浸潤的分值分別為3.94±0.21、3.94±0.21、1.84±0.25和1.84±0.25，均顯著高于野生型小鼠實(shí)驗(yàn)組12 h的3.06±0.01、2.52±0.51、0.46±0.22和0.58±0.38(Plt;0.05)。結(jié)論LPL雜合子小鼠血TG中度升高且穩(wěn)定，在雨蛙肽誘導(dǎo)下產(chǎn)生嚴(yán)重的急性胰腺炎，是研究高脂血癥相關(guān)性急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的一種理想的動物模型。

胰腺炎； 高酯血癥； 脂蛋白酯酶； 雜合子

高脂血癥相關(guān)性急性胰腺炎(LAP)是一種病死率較高的疾病，且復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多，其發(fā)病機(jī)制未完全清楚。為闡明相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，常用高脂食餌飼喂方法制備動物模型，但喂養(yǎng)周期長、動物個體差異易導(dǎo)致模型組血脂水平參差不齊等缺點(diǎn)。本文采用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的雜合子小鼠腹腔分次注射雨蛙肽方法制備高脂血癥相關(guān)性急性胰腺炎模型，并探討這種新模型形成機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及分組

選用北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所提供的4個月齡、雌性、脂蛋白脂酶(LPL)缺陷的雜合子C57BL6小鼠26只和野生型C57BL6小鼠28只，均分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組又分為12、24 h 2個時間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg體重，間隔1 h重復(fù)注射，共注射7次。對照組同法注射等量生理鹽水。距首次給藥12、24 h分別于眶靜脈取血，肝素抗凝，離心，取血漿待測。留取胰腺組織標(biāo)本， 10%甲醛溶液固定。

二、檢測指標(biāo)

1．血三酰甘油(TG)及淀粉酶檢測：均采用北京中生北控生物技術(shù)有限公司提供的ELASA檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作。

2．組織學(xué)檢查：固定的胰腺組織常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，由病理科醫(yī)師閱片。參照Schmidt等[1]方法，即從水腫、炎細(xì)胞浸潤、實(shí)質(zhì)出血、實(shí)質(zhì)壞死、空泡形成等方面進(jìn)行雙盲評分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清TG、淀粉酶水平變化

LPL雜合子實(shí)驗(yàn)組12、24 h的血TG 水平分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3.56±0.32)mmol/L，對照組分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3.55±0.27)mmol/L；野生型實(shí)驗(yàn)組12、24 h的血TG水平分別為(0.92±0.11)mmol/L和(0.92±0.07)mmol/L，對照組為(0.94±0.18)mmol/L和(0.88±0.15)mmol/L。雜合子實(shí)驗(yàn)組及對照組均顯著高于野生型實(shí)驗(yàn)組及對照組(Plt;0.05)。

LPL雜合子實(shí)驗(yàn)組12、24 h的血淀粉酶水平分別為(3685±484)U/L和(3019±643)U/L，對照組分別為(471±23)U/L和(550±93)U/L；野生型實(shí)驗(yàn)組12、24 h的血淀粉酶水平分別為(2501±410)U/L和(2091±701)U/L，對照組為(358±43)U/L和(386±37)U/L。2個對照組之間無顯著差異；2個實(shí)驗(yàn)組均顯著高于其相應(yīng)的對照組(Plt;0.05)；雜合子實(shí)驗(yàn)組顯著高于野生型小鼠實(shí)驗(yàn)組(Plt;0.05)。

二、胰腺病理改變

野生型小鼠對照組的胰腺小葉排列整齊，結(jié)構(gòu)完整(圖1A)；實(shí)驗(yàn)組小鼠胰腺組織明顯水腫，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔增寬，腺泡細(xì)胞點(diǎn)狀壞死(圖1B)。雜合子小鼠對照組的胰腺部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡變性、壞死(圖1C)；實(shí)驗(yàn)組胰腺組織間質(zhì)明顯水腫，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔增寬，腺泡細(xì)胞空泡樣變性、片狀壞死，伴血管充血、血管周圍及間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤 (圖1D)。雜合子小鼠對照組胰腺細(xì)胞壞死較野生型小鼠對照組明顯；雜合子小鼠實(shí)驗(yàn)組胰腺的水腫、壞死、出血及炎細(xì)胞浸潤均較野生型小鼠實(shí)驗(yàn)組顯著(表1，Plt;0.05)。

圖1野生型小鼠對照組(A)、實(shí)驗(yàn)組24 h(B)和雜合子小鼠對照組(C)、實(shí)驗(yàn)組24 h(D)的胰腺病理改變(HE ×200)

表1 各組胰腺組織病理評分

注：與野生型小鼠同組別、同時點(diǎn)比較，aPlt;0.05

討 論

近年來，高三酰甘油血癥已成為急性胰腺炎的發(fā)病原因之一[2]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。而此研究的關(guān)鍵首先是建立合理的動物模型。

高脂血癥動物模型主要有先天性、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因動物3種[3]。由于先天性動物模型來源困難、價格昂貴,實(shí)際應(yīng)用受到限制?；瘜W(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)動物模型包括靜脈或腹腔注射化學(xué)試劑和采用高脂飼料喂養(yǎng)或通過在食物中加入能促進(jìn)肝臟合成膽固醇或三酰甘油的物質(zhì)形成高脂動物模型[4-5]。Takahashi等[6]經(jīng)股靜脈注射Triton WR 1339誘導(dǎo)SD大鼠高TG血癥。TritoWR1339是一種表面活性劑，它可以抑制卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶，影響脂蛋白之間的脂質(zhì)交換和形成脂蛋白復(fù)合物，抑制脂質(zhì)在血液中的清除[7]，使血脂升高。此法簡便、快速，但是不符合人類高脂血癥的形成過程。喂養(yǎng)法形成的高脂動物模型，由于大鼠和小鼠對此類飲食敏感性差，且血漿脂蛋白的合成及清除率與人差異較大，導(dǎo)致模型組血脂水平參差不齊，且喂養(yǎng)時間長，所以很難作為理想的高脂血癥模型。轉(zhuǎn)基因動物模型通過不表達(dá)或過量表達(dá)基因來表現(xiàn)各種疾病。涉及脂質(zhì)代謝的蛋白包括相應(yīng)的受體、載脂蛋白(Apo)、與脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8]。

北京大學(xué)心血管研究所鮑紅梅等[9]與加拿大的合作者一起成功建立了LPL基因敲除C57BL6小鼠。LPL純合子雄性小鼠由于體內(nèi)缺乏LPL，出生后48 h內(nèi)即全部死亡。因此，LPL純合子仔鼠于出生12 h內(nèi)必須用體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移LPL才能成活,該鼠生長至成年表現(xiàn)為極度高的血三酰甘油和自發(fā)性胰腺炎，與人類LPL缺陷一致。

本實(shí)驗(yàn)采用該小鼠與野生型C57BL6小鼠交配后得到的雜合子鼠,具有穩(wěn)定的中度高脂血癥。本組實(shí)驗(yàn)小鼠的血TG為(3.55±0.27)mmol/L，顯著高于野生型小鼠的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同劑量的雨蛙肽誘導(dǎo)下，LPL雜合子小鼠血淀粉酶水平及胰腺的水腫、壞死、出血、炎細(xì)胞浸潤均顯著高于野生型小鼠(Plt;0.05)，發(fā)生更嚴(yán)重的急性胰腺炎。提示在相同致病因素影響下，LPL雜合子小鼠更易發(fā)生胰腺炎或病變程度加重，可見高TG血癥是促進(jìn)胰腺炎發(fā)展和增加易感性的因素，而LPL雜合子小鼠也是一個理想的動物模型。

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2008-11-06)

(本文編輯：屠振興)

Acutepancreatitisinmicewithlipoproteinlipasedeficiency

ZHAO Yan, CHENG Li, WANG Xing-peng, WANG Yu-hui, LIU Guo-qing.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Medical School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

ObjectiveTo establish an experimental animal model of hypertriglyceridemic (HTG) pancreatitis by using special lipoprotein lipase (LPL) deficient HTG heterozygous mice.MethodsLPL deficient HTG heterozygous mice and wild type mice were divided into experiment group and control group, then each group was subdivided into 12 h,24 h subgroup. Acute pancreatitis (AP) was induced by caerulein intra-abdominal injection for 7 times (50 μg/kg) at the interval of 1 h; the mice in the control group

same amount of normal saline. The serum level of TG, amylase was determined, and morphologic changes were scored.ResultsThe serum level of TG in LPL deficient HTG heterozygous mice was (3.55±0.27)mmol/L, which was significantly higher than that of wild type mice [(0.94±0.18) mmol/L,Plt;0.05]. The serum level of TG and amylase in heterozygous mice at 12 h was (3.55±0.27)mmol/L and (3685±484)U/L, which was significantly higher than those in wild type mice [(0.92±0.11)mmol/L and (2501±410)U/L,Plt;0.05]. The pancreatic tissue edema, necrosis, bleeding and inflammatory cell infiltration score was 3.94±0.21, 3.94±0.21, 1.84±0.25 and 1.84±0.25 in heterozygous mice, which was significantly higher than that of wild type mice (3.06±0.01, 2.52±0.51, 0.46±0.22 and 0.58±0.38,Plt;0.05).ConclusionsThe serum level of TG was moderately and stably elevated in heterozygous mice. The mice developed more severe pancreatitis after caerulein induction, which was an ideal experimental model for study of mechanism of HTG pancreatitis．

Pancreatitis; Hypertriglyceridemia； Lipeprotein lipase； Heterozygote

CorrespongdingauthorWANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com;LIUGuo-qing,Emailgeorgeliu@bjmu．edu．ca

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.017

200080 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院消化科(趙嚴(yán)、程禮、王興鵬)；上海同濟(jì)大學(xué)附屬第十醫(yī)院(王興鵬);北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所(王宇輝、劉國慶)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com；劉國慶，Email：georgeliu@bjmu．edu．ca