沈俊 王敏 劉文松 秦仁義

體外侵襲和化療干預(yù)富集PANC1中CD24+CD44+細胞群的初步研究

沈俊 王敏 劉文松 秦仁義

腫瘤由異質(zhì)性的腫瘤細胞組成，其中包含一個在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥中起關(guān)鍵作用的亞群——腫瘤干細胞[1]。近年根據(jù)腫瘤干細胞理論分選到了胰腺癌干細胞(CD24+CD44+ESA+)[2]，而且從胰腺癌細胞系PANC1中分離的CD24+CD44+細胞具有高致瘤性[3]。本實驗探討從胰腺癌細胞系PANC1中富集CD24+CD44+細胞的方法，為進一步研究這種細胞的生物學(xué)特性提供足量的細胞。

一、材料與方法

1．胰腺癌細胞株P(guān)ANC1及分組：胰腺癌細胞株P(guān)ANC1及NIH3T3 細胞株由武漢同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室提供。常規(guī)培養(yǎng)，每48 h胰酶消化傳代1 次。PANC1細胞分為4組：對照組、高侵襲性細胞(PANC1-H)組、低侵襲性細胞(PANC1-L)組和吉西他濱耐藥組。對照組為常規(guī)培養(yǎng)24 h的PANC1細胞。取對數(shù)生長期的NIH3T3細胞制備趨化因子。

2．PANC1-H和PANC1-L細胞的獲?。翰捎肨ranswell小室方法篩選。Transwell小室購自美國Coster公司。RPMI-1640稀釋人工基質(zhì)Matrigel膠(美國Sigma公司)到1 mg/ml，均勻涂布于濾膜上，加入少量無血清的培養(yǎng)基水化，采用紫外線照射殺菌。Transwell小室的下室加入適量含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液以及500 μl趨化因子，上室中加入1 ml無血清RPMI-1640懸浮的對數(shù)生長期PANC1細胞(500～1000個)，常規(guī)培養(yǎng)6、12 h后用0.25%胰酶將穿膜細胞消化下來[3]，為高侵襲性細胞(PANC1-H)，上室中為低侵襲性細胞(PANC1-L)。

3．吉西他濱耐藥細胞的獲?。篜ANC1細胞中分別加入含鹽酸吉西他濱(美國禮來公司)濃度為10 nmol/ml、100 nmol/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，獲取的細胞為吉西他濱耐藥性細胞。

4．CD24+CD44+細胞分析：取上述各組細胞，PBS洗2遍后用PBS重懸，調(diào)整細胞濃度為(0.5～1)×106/ml。取20 μl細胞懸浮液，分別加入抗體CD24-PE、CD44-APC 37℃孵育30 min，PBS洗2遍后用300 μl PBS重懸，流式細胞儀檢測。采用PBS代替一抗作為對照。實驗重復(fù)3次。

二、結(jié)果

PANC1-H 6、12 h組、PANC1-L 6、12 h組、吉西他濱10 nmol/ml、100 nmol/ml組和對照組中CD24+CD44+細胞的比例分別為 (26.1±0.3)%、(17.4±0.4)%、(26.4±0.4)%、(23.7±0.9)%、(50.3±0.4)%、(69.9±0.5)%和(31.7±0.3)%(圖1)。PANC1-H與PANC1-L組中CD24+CD44+細胞的比例無顯著差異，隨著培養(yǎng)時間延長也沒有發(fā)生顯著變化(P值均gt;0.05)；相反，吉西他濱10 nmol/ml、100 nmol/m處理可使CD24+CD44+細胞比例從31.4%～32.0%提高到69.4%～70.4%(圖2)，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

討論目前得到的腫瘤干細胞主要是通過表面分子表型來確定的。在腫瘤干細胞分選過程中用胰酶消化腫瘤細胞成單細胞，可能會對細胞表面分子標志的狀態(tài)及細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控產(chǎn)生一定程度的干擾，而且會對腫瘤干細胞造成極大損傷，不適合于對其更深入研究。胰腺癌細胞系PANC1的研究相對于原代細胞來說[4]，雖然在分選過程中也會受到影響不能確保其原有生物學(xué)特性，但容易獲得，而且無正常組織細胞干擾。近年發(fā)現(xiàn)，PANC1中的CD24+CD44+細胞有高致瘤性，是胰腺癌干細胞的候選細胞之一。腫瘤干細胞具有高侵襲能力和抗化學(xué)藥物的能力[5]。為尋找富集CD24+CD44+細胞的方法，本研究采用了侵襲模型和化療抵抗兩種方法，并進行比較。

圖1PANC1-H 6(A)、12 h組(B)、PANC1-L 6(C)、12 h組(D)和對照組(E)流式細胞檢測CD24+CD44+細胞含量

圖2對照組(A)、吉西他濱10 nmol/ml組(B)和100 nmol/ml組(C)流式細胞檢測CD24+CD44+細胞含量

Transwell小室體外侵襲模型通過模擬體內(nèi)侵襲能力較強的腫瘤細胞能夠脫離原位腫瘤細胞群體，分泌基質(zhì)蛋白溶解酶降解細胞外基質(zhì)(ECM)成分——Matrigel膠,在某特異器官或組織(NIH3T3無血清培養(yǎng)上清)的趨化下發(fā)生侵襲過程。腫瘤細胞可通過Matrigel層,非轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞、成纖維細胞、表皮細胞不能通過[6]。應(yīng)用該法可鑒定細胞的侵襲能力。本實驗通過Transwell小室篩選出高侵襲性的PANC1胰腺癌細胞，但CD24+CD44+細胞僅占26%左右，且與低侵襲性的PANC1胰腺癌細胞及原代PANC1細胞中的CD24+CD44+細胞比例無顯著差異，提示Transwell小室腫瘤侵襲模型不適合用來富集大量的CD24+CD44+細胞。這可能因為腫瘤細胞體內(nèi)侵襲過程至少包括運動因子、黏附分子、趨化因子、胞外基質(zhì)降解酶和血管形成因子5類因子參與穿越腫瘤血管內(nèi)皮和基底膜進入循環(huán)[7]，而Transwell小室體外侵襲模型只能通過降解Matrige膠模擬胞外基質(zhì)降解酶和趨化因子的趨化作用，不能完全代替腫瘤細胞在體內(nèi)環(huán)境下的侵襲過程，達不到富集CD24+CD44+細胞的目的。

本實驗又采用化療藥物鹽酸吉西他濱作用于PANC1胰腺癌細胞系，檢測耐藥癌細胞中CD24+CD44+細胞的含量，結(jié)果顯示，CD24+CD44+細胞比例提高到50%以上，且隨著鹽酸吉西他濱濃度升高，CD24+CD44+細胞比例也有所提高，提示鹽酸吉西他濱化療干預(yù)是一種篩選富集胰腺癌細胞系PANC1中CD24+CD44+細胞較好方法。

[1] Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem cells,cancer,and cancer stem cells.Nature,2001，414:105-111.

[2] Li C,Heidt DG,Dalerba P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells.Cancer Res,2007,67:1030-1037.

[3] 譚曉潔,侯建國,賀松琴,等.采用體外侵襲實驗分離侵襲性人原代腎細胞癌細胞.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,3:318-321.

[4] 李錦軍,顧健人.癌干細胞研究進展.生命科學(xué),2006,18:333-339.

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2008-12-10)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.021

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