張敏敏 楊驊 金晶 吳紅玉 李兆申

·論著·

MHCⅡ類轉激活因子基因的重組腺病毒載體的構建

張敏敏 楊驊 金晶 吳紅玉 李兆申

目的構建含有主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ類分子激活物(CⅡTA)基因的重組腺病毒載體。方法回收CⅡTA的PCR產(chǎn)物插入pUC57中，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，U-Gene凝膠回收純化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切質粒載體pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA連接酶將上述目的基因片段與pShuttle-GFP-CMV片段連接，得到穿梭質粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，并經(jīng)KpnⅠ單酶切及測序鑒定。Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ雙酶切處理，回收目的片段，將pAdxsi載體片段和插入片段進行酶連接，得到腺病毒質粒pAdxsi-GFP-CⅡTA，經(jīng)Xho I酶切鑒定后轉染HEK293細胞并培養(yǎng)出毒。擴增、純化重組腺病毒AdCⅡTA，并測定病毒滴度。結果重組穿梭質粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA經(jīng)Kpn I單酶切及測序分析，證實與GeneBank中公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符。重組腺病毒pAdxsi-GFP-CⅡTA構建成功后在HEK293細胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒AdCⅡTA對HEK293細胞有致病作用。經(jīng)多次重復感染并純化后，病毒滴度達2.0×1011PFU/ml。結論含小鼠CⅡTA基因的重組腺病毒已成功構建。

胰腺腫瘤; 基因，MHCⅡ類; 基因療法

表達明顯減少或缺失，致使T細胞對腫瘤細胞抗原不能識別，腫瘤細胞得以逃避宿主的免疫攻擊[1-2]。MHCⅡ類轉激活子(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)是MHCⅡ類基因表達的“分子開關”，對MHCⅡ類基因的組成和誘導表達起關鍵作用。高度轉移性的腫瘤細胞MHCⅡ類分子的表達下降，其與CⅡTA的表達降低密切相關[3-4]。外源性的CⅡTA能夠促進MHCⅡ基因轉錄的激活[5]，改變MHC分子的表達，促進腫瘤抗原的提呈，從而達到阻斷腫瘤細胞免疫逃逸的目的[3]。為此，我們構建了CⅡTA基因重組腺病毒的表達載體，為進一步的實驗研究奠定基礎。

材料和方法

一、pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA的構建及鑒定

參照文獻[6]的方法。先設計擴增CⅡTA全基因引物。上游引物5′-AATAGAGAGCCACCA-GGGGT-3′，下游引物5′-GTGCTTCTGAGTGCTGCCT-3′，產(chǎn)物片段3300 bp。PCR擴增程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 90 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物電泳后，用U-Gene凝膠回收試劑盒回收、純化。應用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，將PCR產(chǎn)物插入pUC57質粒，制備目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切質粒載體pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA連接酶將上述目的基因片段與pShuttle-GFP-CMV片段連接，轉化DH5a。挑取平板中單個菌落，接種含100 μg/ml Amp的5 ml LB培養(yǎng)液內，震蕩培養(yǎng)過夜。酶切法鑒定陽性菌液。并送上海Sangon公司測序鑒定。

二、pAdxsi-GFP-CⅡTA的構建與鑒定

用Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ雙酶切腺病毒載體pAdxsi，同時雙酶切穿梭質粒載體pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，回收目的片段，連接病毒載體片段和目的片段，轉化大腸桿菌，涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基平皿，挑取若干單克隆菌落，接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將對數(shù)生長期的菌液加入LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，大量提取重組腺病毒，行XhoⅠ酶切鑒定。

三、腺病毒的重組及鑒定

將HEK293細胞(購自加拿大Microbix Biosystems lnc．)接種于6孔板中，每孔5×105細胞，常規(guī)培養(yǎng)過夜。換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至底面積的80%～90%時，取重組腺病毒pAdxsi-GFP-CⅡTA，采用Lipofectamine2000脂質體(GIBCO BRL產(chǎn)品)進行轉染。轉染后第2天，將長滿的細胞傳代于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長滿瓶底時再轉入75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象為細胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。第8天出現(xiàn)細胞出毒現(xiàn)象；第11天大部分細胞病變并從底部脫落，將培養(yǎng)瓶置-70℃冰箱和37℃水浴鍋中反復凍融3次，3000 r/min離心5 min，收集含重組腺病毒(AdCⅡTA)的上清液，為第一代毒種(P1)。

取第一代毒種50 ml接種于25 cm2細胞瓶中培養(yǎng)的HEK293細胞，按前述方法培養(yǎng)、凍融、離心收集病毒上清液，此為第二代毒種(P2)。取200 μl P2上清液，加入20 μl蛋白酶K、200 μl Buffer AL，置56℃水浴10 min，加入200 μl無水乙醇，震蕩混勻。將混合物放入2 ml收集柱內，8000 r/min離心1 min，棄柱下收集管，換新管。向柱內加入500 μl Buffer AW1，8000 r/min離心1 min，換柱下收集管。再向柱內加入500 μl Buffer AW2，13 000 r/min離心3 min，柱下?lián)Q新EP管。向柱內加入100 μl Buffer AE，室溫放置1 min，8000 r/min離心1 min，重復1次。收集2次流出液，取5 μl作為模板，進行PCR鑒定。CⅡTA上游引物5′-CTATGTCCCCTG-TCATTGCTT-3′，下游引物5′-GTCTTGGTTCCC-CGCTGT-3′，產(chǎn)物430 bp。PCR反應參數(shù)：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 50 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物行凝膠電泳分離，觀察。

四、AdCⅡTA的擴增、純化和滴度測定

在5個75 cm2培養(yǎng)瓶中分別接種4×106個HEK293細胞，待細胞生長至90%時，加入2 ml P2液，待細胞完全病變后，凍融3次，離心取病毒上清。然后在4個轉瓶同法染毒70 h后收獲病變細胞混懸液。3000 r/min離心10 min， Tris緩沖液重懸細胞沉淀，反復凍融3次，6000 r/min離心取上清，用DNase消化、0.45 μm濾膜過濾、SOURSE 15Q和分子篩純化。純化后的病毒保存于腺病毒保存液中，經(jīng)除鹽處理后用0.22 μm一次性濾器除菌，分裝保存于-80℃冰箱。用10×的病毒裂解液裂解純化病毒樣品,測定A260和A280。每ml制品中的病毒顆粒數(shù)(VP/ml)=A260×1.1×1012。

結 果

一、重組穿梭質粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA鑒定

pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA經(jīng)Kpn I單酶切后得到2300 bp及6100 bp兩個片段(圖1)，符合目的片段長度。陽性質粒經(jīng)測序分析，與GeneBank公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符。

二、重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-CⅡTA鑒定

pAdxsi-GFP-CⅡTA經(jīng)Xho I酶切后得到7個片段(圖2)，與預期結果一致。

三、重組腺病毒AdCⅡTA的鑒定及滴度

pAdxsi-GFP-CⅡTA在HEK293細胞中包裝產(chǎn)生重組腺病毒AdCⅡ TA。對HEK293細胞有致病作用。轉染后第2天開始出現(xiàn)明顯噬斑，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖3)。

分離收集的病毒，經(jīng)PCR擴增，可以擴增出430 bp的特異性片段(圖4)。

用收集的病毒感染HEK293細胞擴增重組腺病毒，44 h后完全出毒。多次重復感染并純化后，病毒滴度達2.0×1011PFU/ml。

圖1 經(jīng)Kpn I酶切的pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA產(chǎn)物電泳圖

圖2 Xho I酶切的pAdxsi-GFP-CⅡTA的產(chǎn)物電泳圖

圖3 AdCⅡTA感染的HEK293細胞出現(xiàn)綠色熒光

M: marker；1:陽性對照；2:AdCⅡTA病毒；3:陰性對照

討 論

促進機體免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的提呈，制備安全、高效的腫瘤疫苗以提高腫瘤免疫原性，已成為目前腫瘤免疫治療中最受青睞的研究熱點之一。MHCⅡ類分子主要表達于活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞以及APC表面，是T、B細胞活化的必要信號。1993年,瑞士科學家Mach發(fā)現(xiàn)了一種能使裸淋巴細胞綜合征患者重新表達MHCⅡ類分子的新基因CⅡTA[6]。CⅡTA可以定量控制MHCⅡ類分子表達，與MHCⅠ類分子及各種抗原遞呈相關基因如Ii、DM等的表達也有關[7-8]。

腺病毒是基因疫苗、基因治療、組織工程等研究中應用最廣泛的載體之一[9]。本研究選用的Adxsi腺病毒，缺失E1/E3，可允許攝入大的片段，并具有I-Ceu I和I-Sce I酶切位點，能識別較長的非回文序列，2種酶一起使用還可提高連接效率。此外，我們選用的pShuttle-GFP-CMV質粒攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)，能直接在熒光倒置顯微鏡下觀察目的基因表達。本實驗結果顯示，我們成功構建了含小鼠CⅡTA基因的重組腺病毒，病毒滴度達2.0×1011PFU/ml，為下一步進行CⅡTA基因對腫瘤，特別是胰腺癌的治療等研究奠定基礎。

[1] Yazawa T,Kamma H,Fujiwara M,et al.Complicated mechanisms of class Ⅱ transactivator transcription deficiency in small cell lung cancer and neuroblastoma.Am J Pathol,2002,161:291-300.

[2] Xi H, Blanck G.Interferon regulatory factor-2 point mutations in human pancreatic tumors.Int J Cancer,2000,87:803-808.

[3] Shi B,Vinyals A,Alia P,et al.Differential expression of MHC class Ⅱ molecules in highly metastatic breast cancer cells is mediated by the regulation of the CIITA transcription Implication of CIITA in tumor and metastasis development. Int J Biochem Cell Biol,2006,38:544-562.

[4] Satoh A,Ikeda H,Toyota M,et al.Epigenetic inactivation of class Ⅱ transactivator (CIITA) is associated with the absence of interferon-gamma-induced HLA-DR expression in colorectal and gastric cancer cells.Oncogene,2004,23:8876-8886.

[5] Tzortzakaki E,Zika E,Spilianakis C,et al.Steroid receptor coactivator 1 links the steroid and interferon gamma response pathways.Mol Endocrinol,2003,17:2509-2518.

[6] Steimle V,Zufferey M,Otten LA,et al.Complementation cloning of an MHC class Ⅱ transactivator mutated in hereditary MHC class Ⅱ deficiency (or bare lymphocyte syndrome).Cell,1993,75:135-146.

[7] Nagarajan UM,Boss JM,Bushey A.Modulation of gene expression by the MHC class Ⅱ transactivator.J Immunol,2002,169:5078-5088.

[8] Girdlestone J.Synergisticinduction of HLA class Ⅰ expression by RelA and CIITA.Blood,2000,15:3804-3808.

[9] Rouard H,Klonjkowski B,Marquet J,et al.Adenoviral transduction of human ‘clinical grade’ immature dendritic cells enhances costimulatory molecule expression and T-cell stimulatory capacity.J Immunol Methods,2000,241:69-81.

2009-10-10)

(本文編輯：屠振興)

ConstructionofMHCclassⅡtransactivatorrecombinantadenovirusvector

ZHANGMin-min,YANGHua,JINJing,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZHANGMin-min,Email:minminzhang2002@126.com

ObjectiveTo construct a recombinant adenovirus vector containing the gene of major histocompatibility complex (MHC) class Ⅱ transactivator (CⅡTA).MethodsThe restriction fragment of CIITA was inserted into pUC57 vector with EcoRⅠ and XhoⅠ. Then, recombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV CⅡTA was constructed with EcoRⅠ and SalⅠ, and was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. After the treatment with Ⅰ-Ceu Ⅰ and Ⅰ-Sce Ⅰ, the fragment CⅡTA from recombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA was inserted into vector pAdxsi. And the pAdxsi-GFP-CⅡTA was packed into liposome, and was transfected to 293 cells.ResultsRecombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA was constructed successfully. After packed into vector pAdxsi, and transfected to 293 cells, significant virus plaques were observed, which showed the successful homologous recombination. The titer of the purified AdCⅡTA was 2.0×1011PFU/ml.ConclusionsRecombinant adenovirus AdCⅡTA containing gene of MHC class Ⅱ transactivator was established successfully.

Pancreatic neoplasms; Genes, MHC classⅡ; Gene therapy

在多數(shù)腫瘤，包括胰腺癌，主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ類分子

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.012

國家自然科學基金(30600752)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內科

張敏敏，Email: minminzhang2002@126.com