王麗華 李兆申 李淑德 杜奕奇 高軍 龔燕芳 滿曉華 胡先貴

·論著·

甲基轉(zhuǎn)移酶3B基因在胰腺癌中的表達(dá)

王麗華 李兆申 李淑德 杜奕奇 高軍 龔燕芳 滿曉華 胡先貴

目的檢測胰腺癌組織中甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)基因表達(dá)，分析其與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法應(yīng)用實(shí)時定量PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測42例胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織、10例正常胰腺組織中DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果胰腺癌組織、癌旁組織和正常胰腺組織DNMT3B mRNA表達(dá)量分別為9.4±5.9、1.02±0.71 和0，相差非常顯著(Plt;0.05)；DNMT3B蛋白表達(dá)陽性率分別為83.3%、14.3%和10.0%，相差也非常顯著 (Plt;0.01)。DNMT3B mRNA 表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Plt;0.05或Plt;0.01)；DNMT3B蛋白表達(dá)與腫瘤的部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Plt;0.01或Plt;0.0 5)；DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)均與年齡、性別、神經(jīng)浸潤、腫瘤大小、血CEA和CA19-9濃度無關(guān)。結(jié)論胰腺癌DNMT3B mRNA和蛋白高表達(dá)提示胰腺癌已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

胰腺腫瘤； 甲基轉(zhuǎn)移酶類； 基因； 實(shí)時定量PCR； 免疫組織化學(xué)

DNA甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，催化這一過程的是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA-methy1transferases，DNMTs)。DNMTs分為DNMT1、DNMT2和DNMT3，DNMT3又分為DNMT3A和DNMT3B。Benbrahim-Tallaa等[1]報道，DNMT3B的高表達(dá)能夠?qū)е抡w的DNA高甲基化和基因沉默，而DNMT1主要維持這些效應(yīng)。已有研究報道，DNMT1在胰腺癌中呈高表達(dá)，而DNMT3B在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用不詳。為此，本實(shí)驗檢測胰腺癌組織DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)，分析其與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系。

材料和方法

一、臨床資料

收集2007年8月至2008年7月我院手術(shù)治療的經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌患者42例，其中男32例，女10例，年齡36～86歲，中位年齡62歲。所有患者術(shù)前均未行化療和放療。同時取我科實(shí)驗室保存的10例正常胰腺組織作為對照，標(biāo)本來自意外死亡者，均得到家屬同意，并簽署書面知情同意書。

二、方法

1．實(shí)時定量PCR：應(yīng)用Trizol(Sigma公司)抽提總RNA，然后用TaKaRa公司的PrimeScript TMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。DNMT3B上游引物5′-TTGAATATGAAGCCCCCAAG-3′，下游引物5′-TGATATTCCCCTCGTGCTTC-3′，產(chǎn)物201 bp;內(nèi)參18S上游引物5′-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′，下游引物5′-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3′,產(chǎn)物294 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增曲線程序：95℃ 10 s;95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個循環(huán)。 溶解曲線反應(yīng)程序：95℃ 15 s,60℃ 60 s, 95℃15 s。胰腺癌或相應(yīng)癌旁組織△Ct值與10例正常胰腺的△Ct均值相比得到△△Ct，通過計算得到RQ值，RQ=-△△Ct。

2．免疫組織化學(xué)染色法：采用常規(guī)鏈霉素抗生物素-過氧化酶方法。用PBS替代一抗作為陰性對照，胃癌標(biāo)本為陽性對照。胞核呈棕黃色染色判定為陽性。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，每視野計數(shù)500個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞率和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別計分。陽性細(xì)胞率≤25%為0分，26% ～ 50%為1分，51% ～ 75%為2分，≥76%為3分?；疚粗蛉旧珡?qiáng)度與背景相似者為0分，著色淺略高于背景色為1分，中等著色明顯高于背景而呈棕黃色為2分，強(qiáng)染呈深棕黃色者為3分。根據(jù)兩項積分之和將DNMT3B表達(dá)分為4級：0分和1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3分和4分為中等強(qiáng)度陽性(++)，5分及以上者為強(qiáng)陽性(+++)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織中DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)

擴(kuò)增曲線和溶解曲線顯示DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物比較單一，在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)(圖1)。

胰腺癌DNMT3B mRNA的RQ值為9.4±5.9，顯著高于癌旁組織的1.02±0.71和正常組織的0(P值均lt;0.05)。DNMT3B蛋白陽性染色主要位于腫瘤細(xì)胞胞核。胰腺癌組織的陽性表達(dá)率為83.3%(35/42)，其中+9例，++17例，+++9例；相應(yīng)癌旁組織的陽性率為14.3%(6/42)，其中+4例，++2例；正常胰腺組織的陽性率為10.0%(1/10),強(qiáng)度為+(圖2)。胰腺癌DNMT3B蛋白表達(dá)陽性率顯著高于正常胰腺組織和癌旁組織(P值均lt;0.01)。

圖1 內(nèi)參照18S(A)和DNMT3B(B)的實(shí)時RT-PCR擴(kuò)增曲線(1)與溶解曲線(2)

圖2 DNMT3B蛋白在正常胰腺組織(A)、癌旁組織(B)和胰腺癌組織(C、D)中的表達(dá)(SP ×400)

二、胰腺癌組織DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

DNMT3B mRNA 表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Plt;0.05或Plt;0.01)；DNMT3B蛋白表達(dá)與腫瘤的部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Plt;0.01或Plt;0.05)。它們與年齡、性別、神經(jīng)浸潤、腫瘤大小、血CEA和CA19-9濃度均無關(guān)(表1)。

表1胰腺癌組織DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

臨床病理參數(shù)例數(shù)DNMT3BmRNA表達(dá)(x±s)DNMT3B蛋白表達(dá)率(%)年齡(歲) lt;601910．5±6．778．9 ≥60238．5±5．287．0性別 男329．0±5．384．4 女1010．6±7．880．0腫瘤部位 胰體尾1010．6±6．8100．0b 胰頭329．0±5．778．1腫瘤直徑(cm) lt;32710．1±6．587．8 ≥3158．1±4．793．3TNM分期 Ⅰ63．8±2．3a66．7 Ⅱ3310．0±5．884．8 Ⅲ313．6±6．4100．0分化程度 低分化913．8±5．0a88．9 中高分化338．2±5．781．8淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2512．8±5．1b96．0a 無174．3±2．364．7神經(jīng)浸潤 有319．6±6．087．1 無118．9±5．972．7CEA(ng/ml) lt;10349．4±5．788．2 ≥1089．7±7．162．5CA19?9(ng/ml) lt;37712．3±4．6100．0 ≥37358．8±6．180．0

注：aPlt;0.05；bPlt;0.01

討 論

通常情況下，DNA 甲基化和染色質(zhì)的緊縮狀態(tài)與基因處于抑制和靜息狀態(tài)相關(guān)；而DNA 的去甲基化和染色質(zhì)的松解狀態(tài)與基因活化和行使功能有關(guān)。DNA 高甲基化的變化會引起基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞惡變，最終形成腫瘤[2]。

文獻(xiàn)報道[3-6]，DNMT3B高表達(dá)在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。Park等[3]研究表明，肝癌組織DNMT3B mRNA高表達(dá)，且與患者生存期短和預(yù)后較差明顯相關(guān)。Girault等[7]報道，乳腺癌組織DNMT3B mRNA高表達(dá)與腫瘤高分化相關(guān)，預(yù)后較差。本實(shí)驗結(jié)果顯示，胰腺癌DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁和正常胰腺組織，且與腫瘤部位、臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示DNMT3B基因可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。但胰腺癌組織DNMT3B mRNA和蛋白兩者的高表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系并不完全一致，其原因可能與樣本量相對較少及DNMT的多種亞型在生物體內(nèi)有協(xié)同作用有關(guān)。Ding等[4]也報道過胃癌DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性并不一致。

[1] Benbrahim-Tallaa L,Waterland RA,Dill AL,et al.Tumor suppressor gene inactivation during cadmium-induced malignant transformation of human prostate cells correlates with over-expression of de novo DNA methyltransferase.Environ Health Perspect,2007,115:1454-1459.

[2] Das PM,Singal R.DNA methylation and cancer.J Clin Oncol,2004,22:4632-4642.

[3] Park HJ,Yu E,Shim YH.DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation in human hepatocellular carcinoma.Cancer Lett,2006,233:271-278.

[4] Ding WJ,Fang JY,Chen XY,et al.The expression and clinical significance of DNA methyltransferase proteins in human gastric cancer.Dig Dis Sci,2008,53:2083-2089.

[5] Lin RK,Hsu HS,Chang JW,et al.Alteration of DNA methyltransferases contributes to 5′CpG methylation and poor prognosis in lung cancer.Lung Cancer,2007,55:205-213.

[6] Oh BK,Kim H,Park HJ,et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation in human hepatocellular carcinoma and their clinicopathological correlation.Int J Mol Med,2007,20:65-73.

[7] Girault I,Tozlu S,Lidereau R, et al.Expression analysis of DNA methyltransferases 1,3A,and 3B in sporadic breast carcinomas.Clin Cancer Res,2003,9:4415-4422.

2009-04-24)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofDNA-methy1transferases3Bgeneinpancreaticadenocarcinoma

WANGLi-hua,LIZhao-shen,LIShu-de,DUYi-qi,GAOJun,GONGYan-fang,MANXiao-hua,HUXian-gui.

DepartmentofGastroenterology，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China

LIShu-de，Email：lishude57@126.com;LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the expression of DNA-methy1transferases 3B (DNMT3B) gene in human pancreatic carcinoma and to evaluate its relationship with clinicopathologic parameters.Methods42 samples of pancreatic carcinoma tissues and 42 para-carcinoma tissues and 10 normal pancreatic tissues were collected and the expression of DNMT3B mRNA and protein was detected by real-time PCR and immunohistochemistry techniques.ResultsThe expression of DNMT3B mRNA (RQ level) in human pancreatic carcinoma tissues and para-carcinoma tissues, normal pancreatic tissues was 9.4±5.9, 1.02±0.71 and 0, respectively, and the difference was statistically significant (Plt;0.05). The rate of expression of DNMT3B protein in human pancreatic carcinoma tissues, para-carcinoma tissues and normal pancreatic tissues were 83.3%, 14.3% and 10%, respectively, and the difference was also statistically significant (Plt;0.01). The expression of DNMT3B mRNA correlated significantly with clinical staging, differentiation degree of the tumor and lymph node metastasis (Plt;0.01 orPlt;0.05). The expression of DNMT3B protein correlated significantly with the location of the tumor and lymph node metastasis (Plt;0.01 orPlt;0.05). The expression of DNMT3B mRNA and protein was not associated with age, sex, neural invasion, tumor size, serum CEA and CA19-9.ConclusionsHighly expressed DNMT3B mRNA and protein may indicate the lymph node metastasis and poor prognosis in human pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasm; Methyltransferases; Gene; Real quantitative RT-PCR; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.004

國家科技支撐計劃資助(2006BAI2A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(王麗華、李兆申、李淑德、杜奕奇、高軍、龔燕芳、滿曉華)，普三科(胡先貴)

共同通信作者：李淑德，Email: lishude57@126.com;李兆申，Email:zhsli@81890.net