蔡玉琦， 張佳鑫， 陳繼發(fā)

（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西省高等學校硒農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，江西宜春336000）

腸道微生物能夠參與宿主養(yǎng)分消化吸收，調(diào)節(jié)機體新陳代謝，維持機體免疫功能（Clavijo 等，2018；Horai 等，2017；Tremaroli 等，2012）。 微生物多樣性降低或菌群結(jié)構失衡易導致宿主免疫機能下降、養(yǎng)分利用率降低、生長或生產(chǎn)性能下降（Wu等，2021；Zhang 等，2021）。 許多因素能夠影響動物腸道菌群結(jié)構及微生物多樣性。研究表明，多種霉菌毒素可降低動物腸道微生物多樣性， 造成腸道菌群結(jié)構紊亂 （劉錦芳等，2019；Payros 等，2017；楊俊花等，2016）。過度繁殖的有害菌會打破腸道正常菌群的生態(tài)平衡， 降低腸道微生物多樣性，破壞腸黏膜屏障功能（Xing 等，2021）。 當前，我國配合飼料普遍受到低劑量霉菌毒素[含量在我國《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078—2017）限定范圍內(nèi)]污染（丁燕玲等，2021），同時動物飼料中已全面禁止添加促生長類抗生素。 因此，探尋安全、有效的飼料添加劑來調(diào)節(jié)動物腸道菌群， 改善腸道健康是實現(xiàn)蛋雞高效生產(chǎn)的重要課題。目前，應用較為廣泛的霉菌毒素脫毒方法是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑（MA），蒙脫石等硅鋁酸鹽類MA能夠吸附多種霉菌毒素， 有效干預霉菌毒素對動物健康造成的負面影響（Yang 等，2014；Wan 等，2013）。 植物精油（EO）和有機酸（OA）具有良好的防霉、抗菌、抑炎等作用，可調(diào)節(jié)家禽腸道菌群結(jié)構， 改善腸道健康（張嘉琦等，2021； 馬嘉瑜等，2021；Hamid 等，2018）。 然而，應用單一飼料添加劑難以有效替代飼用抗生素及干預霉菌毒素的毒性?；贛A、OA 和EO 的功能，推測MA-OA 復合物和MA-EO 復合物也許能有效控制霉菌毒素、 有害菌等對蛋雞的危害， 調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構，提高微生物多樣性，改善腸道健康。 另外，研究發(fā)現(xiàn)，添加MA-OA 復合物、MA-EO 復合物有提高蛋雞產(chǎn)蛋率的趨勢，顯著提高了蛋重（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）， 推測可能與二者調(diào)節(jié)蛋雞腸道菌群有關。 因此，本試驗在含有多種低濃度霉菌毒素飼糧中添加MA-OA 復合物和MA-EO復合物，研究其對蛋雞盲腸微生物多樣性、菌群結(jié)構及物種豐度的影響， 為二者在蛋雞生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 MA-EO 復合物主要成分為：MA（蒙脫石）75%，EO （主要為丁香酚和肉桂醛）含量> 4%；MA-OA 復合物成主要分為：MA （蒙脫石）80%，OA（主要為甲酸、丙酸和丁酸）>10%。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理 將270 只29 周齡的健康羅曼蛋雞隨機分為3 組，每組6 個重復，每個重復15 只。 對照組（CON 組）飼喂基礎飼糧，試驗組分別飼喂在基礎飼糧中添加0.70 g/kg MA-EO復合物 （MEO 組） 和0.65 g/kg MA-OA 復合物（MOA 組）的試驗飼糧。 預試期1 周，正試期10周。 基礎飼糧參照《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33-2004）設計， 其組成及營養(yǎng)水平見陳繼發(fā)和耿曉峰（2020）文獻。

蛋雞采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)3 只。試驗1 ~ 10 周雞舍平均溫度、相對濕度分別為（26±3）℃、（77±6）%。 每日喂料2 次，自由飲水，光照時間為16 h/d。

1.3 樣品采集 試驗第70 天， 從各重復隨機抽取1 只蛋雞，參照曲湘勇等（2019）的方法采集蛋雞盲腸內(nèi)容物樣品。

1.4 腸道微生物分析 提取蛋雞盲腸內(nèi)容物細菌DNA 后， 采用通用引物338F/806R 對細菌16S rRNA V4 區(qū)進行PCR 擴增，用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物， 用AxyPreP DNA Gel Extraction Kit 進行純化，QuantusTMFlurometer 進行定量檢測，使用NEXTFLEXRRepid DNA-Seq PE300平臺測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 盲腸微生物原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，F(xiàn)lash 軟件拼接。對優(yōu)化后的序列根據(jù)97%的相似度進行操作分類單元（OTU）聚類，對生成的OTU 信息進行細菌群落多樣性和豐富度分析。 數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進行Kruskal-Wallis 檢驗， 用Duncan 氏法進行多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P< 0.05 表示差異顯著，0.05≤P< 0.10 表示有變化的趨勢。

2 結(jié)果

2.1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群測序數(shù)據(jù)與α 多樣性的影響 由表1可知，各組樣品測序覆蓋率均在99.6%以上，說明測序深度已基本覆蓋到樣品中的所有物種。 MOA組、MEO 組樣品測序獲得的有效序列和盲腸菌群Shannon 指 數(shù)、Ace 指 數(shù)、Chao 指 數(shù) 較CON 組 均有不同程度的提高（P> 0.05）。

表1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群測序數(shù)據(jù)與α 多樣性的影響

2.2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群β 多樣性的影響 如圖1 所示，CON組、MEO 組菌群結(jié)構分布相對緊湊， 說明其物種相似度較高。 而MOA 組菌群結(jié)構分布相對分散，說明其物種相似度較低，群落構成差異較大。

圖1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群β 多樣性的影響

2.3 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群物種豐度的影響

2.3.1 門水平 由表2 可知，在門水平上，各組中相對豐度大于1%的菌門有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門， 其中擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌門，占比達到90%左右。 各組間相對豐度大于0.15%的菌門相對豐度均無顯著差異（P>0.05）。與CON 組相比，MOA 組、MEO 組綠灣菌門相對豐度顯著降低（P< 0.05）。

表2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群門水平上相對豐度的影響

2.3.2 屬水平 由表3 可知， 各組間蛋雞盲腸優(yōu)勢菌屬存在一定差異， 且以擬桿菌屬相對豐度最高，其序列約占測序總量的32%。 CON 組相對豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 未明確瘤胃菌科、理研菌科RC9 群和考拉桿菌屬；MOA 組相對豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 理研菌科RC9 群、考拉桿菌屬和柔嫩梭菌屬；而MEO 組相對豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 理研菌科RC9 群、考拉桿菌屬和柔嫩梭菌屬。 與CON 組相比，MEO 組、MOA 組理研菌屬相對豐度有提高的趨勢（P=0.099），腸球菌屬相對豐度有降低的趨勢（P=0.097），大腸志賀氏桿菌、梭桿菌屬相對豐度有不同程度的降低（P> 0.05），乳酸桿菌屬相對豐度有不同程度的提高 （P> 0.05）；MOA 組帕拉普氏菌屬、 未明確厭氧繩菌科和未明確亞硝化單胞菌科相對豐度顯著降低（P< 0.05），瘤胃梭菌屬_1 相對豐度顯著提高（P< 0.05），未明確克里斯滕森菌科、 不動桿菌屬和丁酸球菌屬相對豐度有提高的趨勢（0.05≤P< 0.10），雙歧桿菌屬相對豐度有不同程度的提高（P> 0.05）。

表3 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群屬水平上相對豐度的影響

2.4 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸差異微生物的影響 通過LEfSe 分析屬水平上具有顯著差異的微生物 （圖2）。 與CON 組相比，MOA 組乳酸桿菌屬、瘤胃梭菌屬_1、瘤胃菌科V9D2013 群、未明確克里斯滕森菌科和理研菌屬等顯著富集；MEO 組未明確消化球菌科和未分類厚壁菌門顯著富集。與MEO 組相比，MOA 組臭氣桿菌屬、丁酸球菌屬、瘤胃梭菌屬_1、克里斯滕森菌科R_7 群、未明確克里斯滕森菌科和瘤胃菌科_UCG-014 等顯著富集。

圖2 差異微生物LEfSe 分析

3 討論

3.1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群多樣性的影響 腸道菌群多樣性與菌群穩(wěn)定性、機體新陳代謝及免疫防御能力等呈正相關（Butel，2014）。 本試驗中，各組樣品間α 多樣性指數(shù)均無顯著差異， 但MEO 組、MOA 組Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)較CON 組均有一定提高。 另外，經(jīng)PCoA方法分析β 多樣性發(fā)現(xiàn)，MOA 組菌群結(jié)構分布相對零散，相似度較低，提示樣品中群落構成差異較大。 以上試驗結(jié)果提示MA-OA 復合物和MA-EO復合物對蛋雞盲腸菌群多樣性的影響是正面的。研究發(fā)現(xiàn)，在含有多種低劑量霉菌毒素飼糧中添加蒙脫石對蛋雞盲腸菌群α 多樣性和β 多樣性無顯著影響（陳繼發(fā)，2017）。容庭等（2018）研究表明，添加0.2%、0.3%酸化劑對肉雞回腸菌群多樣性沒有產(chǎn)生顯著影響。 Feng 等（2021）報道，飼糧中添加牛至精油對蛋雞回腸菌群Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均無顯著影響，但在一定程度上提高了回腸菌群β 多樣性。 以上研究結(jié)果與本試驗結(jié)果基本一致。 研究證實，多種霉菌毒素對動物腸道菌群結(jié)構及微生物多樣性會造成顯著負面影響（Liu 等，2019；Payros 等，2017；Yang 等，2016）。 本試驗蛋雞飼糧被多種霉菌毒素污染，但毒素含量處于安全范圍內(nèi)（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020），其可能不會顯著降低蛋雞腸道微生物多樣性， 進而添加MA-OA 復合物、MA-EO 復合物沒有對蛋雞腸道菌群多樣性產(chǎn)生顯著影響。

3.2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群結(jié)構和物種豐度的影響 家禽腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成（程浩等，2021；曲湘勇等，2019）。本試驗中蛋雞盲腸菌群擬桿菌門和厚壁菌門占比達到90%， 與前人的研究結(jié)果基本一致。 添加MA-EO 復合物和MA-OA 復合物對蛋雞盲腸菌群優(yōu)勢菌門相對豐度沒有產(chǎn)生顯著影響，可能與健康成年蛋雞腸道內(nèi)已形成穩(wěn)定的微生物區(qū)系有關。 在門水平上，MEO 組、MOA 組綠灣菌門相對豐度較CON 組顯著降低。 綠灣菌門是一類通過光合作用產(chǎn)生能量的細菌， 是一種化能異養(yǎng)型細菌。 研究指出，綠灣菌門相對豐度與含水量呈負相關（康寶天等，2020）。本研究中，試驗組綠灣菌門相對豐度顯著降低，可能是由于飼料中添加了具有吸水性的蒙脫石。 另外， 本研究發(fā)現(xiàn)，MEO 組、MOA組梭桿菌門相對豐度較CON 組分別降低了43.71%、63.47%。Gao 等（2017）報道，結(jié)直腸癌患者腸道梭桿菌門相對豐度顯著升高，提示此菌門豐度增加與腸道疾病有關。

在屬水平上，MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞盲腸菌群優(yōu)勢菌屬相對豐度沒有產(chǎn)生顯著影響， 但在一定程度上優(yōu)化了菌群結(jié)構。 MEO 組、MOA 組大腸志賀氏桿菌、梭桿菌屬和腸球菌屬相對豐度較CON 組均有一定降低。 大腸志賀氏桿菌是腸道致病菌，可誘發(fā)腸炎，釋放細菌毒素，引起細菌及毒素“移位”。梭桿菌屬包含壞死梭桿菌、潰瘍梭桿菌和核梭桿菌等多種致病菌。苗慧芳等（2014）報道，與健康人相比，結(jié)直腸癌患者糞便中梭桿菌屬相對豐度顯著升高；Gao 等（2017）研究表明，梭桿菌屬被鑒定為結(jié)直腸癌發(fā)生的關鍵因素，說明此菌屬豐度提高與消化道疾病有關。 腸球菌屬是革蘭氏陽性菌中僅次于葡萄球菌屬的重要醫(yī)院感染病原菌，可引起尿路感染、腹部創(chuàng)傷和術后感染。

同時，經(jīng)LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)，添加MA-OA 復合物使蛋雞盲腸乳酸桿菌屬、未明確克里斯滕森菌科和理研菌屬顯著富集，且一定程度上提高了丁酸球菌屬和雙歧桿菌屬相對豐度。乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是家禽腸道中有益菌群， 對宿主發(fā)揮營養(yǎng)、代謝和免疫等多重生理功能， 有利于維護宿主健康（Fukuda 等，2011）。 丁酸球菌屬是腸道中優(yōu)勢的產(chǎn)丁酸菌，能發(fā)酵各種碳水化合物生成丁酸，丁酸可為腸上皮細胞生長提供能量（Fukuda 等，2011）。 據(jù)報道， 理研菌屬是腸道內(nèi)具有保護性功能的菌群，楊俊花等（2016）研究表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇顯著降低了小鼠腸道理研菌屬相對豐度。本試驗蛋雞飼糧中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等多種霉菌毒素（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）， 提示添加MA-OA 復合物可能干預低濃度霉菌毒素對蛋雞腸道菌群結(jié)構造成的負面影響。 克里斯滕森菌科屬于厚壁菌門，其與炎癥性腸病、 代謝綜合征等顯著負相關（Waters 等，2019）。另外，LEfSe 分析顯示，與MEO 組相比，MOA 組丁酸球菌屬、 克里斯滕森菌科R_7 群、未明確克里斯滕森菌科等顯著富集， 提示添加MA-OA 復合物對提高有益菌屬豐度的作用優(yōu)于MA-EO 復合物， 可能與OA 能夠降低腸道pH，抑制有害菌生長，促進有益菌增殖有關。綜上所述，添加MA-EO 復合物和MA-OA 復合物在一定程度上降低了部分有害菌屬相對豐度，MA-OA 復合物可促進部分有益菌屬富集，說明其可調(diào)節(jié)蛋雞盲腸菌群結(jié)構，這可能是二者在一定程度上提高蛋雞生產(chǎn)性能（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）的主要原因之一。

4 結(jié)論

飼糧添加0.65 g/kg MA-OA 復合物能夠在一定程度上提高蛋雞盲腸微生物多樣性， 優(yōu)化腸道菌群結(jié)構。