羅　彪　梁　謹(jǐn)　黃世慶　黃　冰　侯雙雁　黃嵩峰

【關(guān)鍵詞】小檗堿；鼻咽癌；CNE-2細(xì)胞；鈣含量

文章編號(hào)：1003-1383(2009)01-0086-02

中圖分類(lèi)號(hào)：R 739.63

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Bお

研究表明，小檗堿對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有明顯的抑制作用［1］。細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體參與了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的過(guò)程，線(xiàn)粒體的功能與線(xiàn)粒體膜的通透性即跨膜電位差密切相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)［2］，細(xì)胞內(nèi)大量鈣離子儲(chǔ)存于線(xiàn)粒體內(nèi)，鈣離子在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重大作用。本研究小檗堿作用于體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，觀察CNE-2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平變化，探討小檗堿對(duì)鼻咽癌CNE-2瘤株抑制的分子機(jī)理。

材料和方法

1.藥品小檗堿由本院自行采集， RPMI-1640 培養(yǎng)基為 Gibco-BRL產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。鈣離子熒光指示劑：Fluo-3/AM為Sigma公司產(chǎn)品，用二甲基亞砜(DMSO)配成1.0 mM濃度。

2.細(xì)胞株人鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，本院傳代保存。

3.方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng):CNE-2細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 U/ml，谷氨酸 30 μg/ml）置37℃， 5%CO₂、飽和濕度中培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

(2)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)［1］：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1×10⁶個(gè)/ml，接種于 96 孔板， 24 h后分別加入終濃度為：20 mg/L，40 mg/L的小檗堿，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（加實(shí)驗(yàn)組等體積培養(yǎng)液做對(duì)照），每組6復(fù)孔。藥物作用48 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

(3)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量測(cè)定：①I(mǎi)ECa測(cè)定方法［3］：用不含Ca、Mg的磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml漂洗細(xì)胞2次（1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘），棄上清后，用PBS稀釋?zhuān){(diào)節(jié)CNE-2細(xì)胞數(shù)為6×105/ml配成細(xì)胞懸液。取兩支5 ml試管，第1支加細(xì)胞懸液490 μl和10 μl 1.0 mM的Fluo-3/AM液；第2支僅取500 μl細(xì)胞懸液，不加Fluo-3/AM液，兩支試管均在37℃條件下孵育30分鐘，用無(wú)Ca²⁺PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，最后加500 μl無(wú)Ca²⁺PBS緩沖液待檢。②CNE-2細(xì)胞內(nèi)鈣離子(IECa²⁺)的流式細(xì)胞定量檢測(cè):應(yīng)用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn))。每份標(biāo)本(包括Fluo-3/AM染色管和無(wú)Fluo-3/AM染色管)均收檢2萬(wàn)個(gè)CNE-2細(xì)胞。激光源為488 nm氬離子激光，取數(shù)之點(diǎn)圖X軸取前向散射(FSC)Y軸取側(cè)向散射(SSC);以組方圖檢測(cè)熒光強(qiáng)度:熒光素Fluo-3強(qiáng)度為X軸、Y軸為細(xì)胞數(shù)。③熒光散射強(qiáng)度FL3-H以對(duì)數(shù)(log值)放大，計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)檢數(shù)據(jù)。檢測(cè)條件(包括染色時(shí)間、濃度、溫度及電壓等)保持穩(wěn)定。以CellQuestPlot軟件(BD公司生產(chǎn))分析每例樣品Fluo-3/AM染色管或無(wú)Fluo-3/AM染色管CNE-2細(xì)胞熒光強(qiáng)度(平均道數(shù)值)，得出每例IECa含量(以細(xì)胞內(nèi)鈣離子指數(shù)表示IECa²⁺):

IECa²⁺＝(受Fluo-3/AM作用后CNE-2細(xì)胞熒光強(qiáng)度平均道數(shù))/(無(wú)FLuo-3/AM作用CNE-2細(xì)胞熒光強(qiáng)度平均道數(shù))×1000

結(jié)果

20 mg/L、40 mg/L小檗堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作用后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，經(jīng)小檗堿處理CNE-2細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量增多，與空白組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

討論

小檗堿對(duì)很多腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖有抑制作用，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有明顯的抑制作用［1］，但作用的分子機(jī)制尚不清楚。離子鈣是細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺唯一的生理活性形式，作為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的第二信使，在細(xì)胞的生理調(diào)控中起著重要的作用。線(xiàn)粒體參與了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞凋亡早期，線(xiàn)粒體首先出現(xiàn)形態(tài)改變，同時(shí)它參與細(xì)胞呼吸、氧的代謝、酶活性和能量供應(yīng)。這些功能與線(xiàn)粒體膜的通透性即跨膜電位差密切相關(guān)。線(xiàn)粒體以一種獨(dú)特的方式調(diào)控著與細(xì)胞凋亡有關(guān)的因子如鈣離子等。線(xiàn)粒體釋放這些因子可抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此，被認(rèn)為是凋亡調(diào)節(jié)中心［4］。細(xì)胞內(nèi)大量鈣離子儲(chǔ)存于線(xiàn)粒體內(nèi)，鈣離子在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著主要作用［2］。本研究顯示，小檗堿可上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2內(nèi)IECa²⁺含量，提示小檗堿通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化影響線(xiàn)粒體的功能，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的過(guò)程，其他參與小檗堿抗鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖和促凋亡機(jī)制有待深入研究闡明。

參考文獻(xiàn)

［1］羅彪，韋啟后，梁謹(jǐn)，等.小檗堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用［J］.右江醫(yī)學(xué)，2006，34(4):373-374.

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［3］尹格平，郝天羽，袁瑋，等.妊高征患者外周血紅細(xì)胞內(nèi)鈣含量測(cè)定及其臨床價(jià)值［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2001，9（2）：20-23.

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(收稿日期：2008-12-30修回日期：2009-02-10)

(編輯：潘明志)