王偉利　段建偉　羅　理　姜　蘭　鄒為民

摘要通過(guò)HPLC方法對(duì)土霉素對(duì)照品進(jìn)樣分析，繪制了土霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=355 00 x+238，檢測(cè)限為0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，在0.005~10.000μg/mL之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=1.000 0。使用乙酸乙酯和不同體積高氯酸萃取，發(fā)現(xiàn)：使用乙酸乙酯萃取效率略低于5%高氯酸，但因?yàn)榉悬c(diǎn)低易于濃縮的優(yōu)勢(shì)，在滿(mǎn)足試驗(yàn)要求的前提下可以考慮使用乙酸乙酯萃??；對(duì)于血液和肌肉中土霉素的萃取，考慮時(shí)間和試劑消耗，10mL的5%高氯酸1次萃取即可滿(mǎn)足一般檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞土霉素；回收率；變異系數(shù)；固相萃取

中圖分類(lèi)號(hào)X836文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-5739（2009）07-0203-02

土霉素是四環(huán)素類(lèi)藥物，作用機(jī)制是通過(guò)與核糖體30s亞基的特異性結(jié)合，抑制肽鏈延長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成；抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均有抑制作用。近年來(lái)，由于耐藥性嚴(yán)重，已經(jīng)減少了其在生產(chǎn)、臨床上的使用。由于土霉素在可食性產(chǎn)品中的殘留會(huì)對(duì)骨骼和牙齒產(chǎn)生不可逆的色素沉著等不良影響。因此，控制土霉素的使用，實(shí)施對(duì)動(dòng)物性食品中土霉素及有害代謝產(chǎn)物殘留的檢測(cè)十分重要。世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國(guó)政府對(duì)魚(yú)肉中土霉素的殘留都做出了嚴(yán)格的規(guī)定，其殘留限量不得高于0.1mg/kg。

有關(guān)土霉素的藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究已經(jīng)見(jiàn)有很多報(bào)道，多數(shù)通過(guò)0.5%~5.0%高氯酸萃取和固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理，但是由于高氯酸難以濃縮，使用固相萃取小柱凈化、有機(jī)溶劑洗脫，雖然易于濃縮，但成本較高。

本試驗(yàn)以羅非魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)比較乙酸乙酯和高氯酸對(duì)土霉素的萃取效果、不同劑量高氯酸萃取回收率、高氯酸對(duì)組織中土霉素的回收率及固相萃取中不同溶劑洗脫雜質(zhì)的回收效果等，以期對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物組織中土霉素萃取方法的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。Water 2695高效液相色譜儀、2487紫外檢測(cè)器，SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取儀，美國(guó)Orga-nomation N-EVAPTM 112氮吹濃縮儀，德國(guó)IKA T18勻漿機(jī)，SIGMA 3K158離心機(jī)，瑞士METTLER TOLEDO的pH計(jì)和分析天平，太倉(cāng)市科教器材廠VORTEX SHAKER WH-861型振蕩器。

1.1.2試劑。土霉素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)130487-200302，含量88.2%）；乙腈、甲醇、正己烷均為HPLC級(jí)；乙二胺四乙酸二鈉為超級(jí)純，MBCHEM公司產(chǎn)品；硝酸、乙酸乙酯、高氯酸、磷酸二氫鈉等均為分析純；Waters OASIS HLB 3cc/60mg固相萃取柱；試驗(yàn)用羅非魚(yú)由珠江水產(chǎn)研究所基地提供。

1.1.3試劑的配制。土霉素儲(chǔ)備液：稱(chēng)取土霉素對(duì)照品0.01g溶于100mL、pH值2.5、0.01moL的NaH2PO4，4℃保存，1個(gè)月內(nèi)有效；5%乙二胺四乙酸二鈉溶液：取5g的EDTA-2Na用蒸餾水定容至100mL；0.01moL的NaH2PO4：稱(chēng)取1.56g的 NaH2PO4·2H2O溶于蒸餾水中，定容至1 000mL，以硝酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，0.45μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1液相色譜條件。根據(jù)水產(chǎn)品中土霉素殘留量的測(cè)定SC/T 3015-2002標(biāo)準(zhǔn)，略有調(diào)整；色譜柱：Waters Atlantis C18，5μm，4.6mm×150mm Column；檢測(cè)器：Waters 2487紫外檢測(cè)器；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：乙腈-0.01moL磷酸二氫鈉溶液=26-74。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將土霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋至10 μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.002 5 μg/mL，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.3樣品準(zhǔn)備。試驗(yàn)用羅非魚(yú)10條（平均體重200±10g），經(jīng)檢測(cè)血液和肌肉中不含土霉素。采集血液使用0.1%的肝素鈉抗凝，準(zhǔn)確定量均分至1mL/份；背部?jī)蓚?cè)肌肉去磷片、去皮，準(zhǔn)確定量均分至1g/份。

1.2.4乙酸乙酯與高氯酸萃取回收率比較。取血液2份，分別加入1μg/mL土霉素對(duì)照品，回旋振蕩器振蕩5min；分別用1mL的5%高氯酸和1mL乙酸乙酯萃取，方法如下：勻漿30s；振蕩3min；5 000rpm 離心5min；取上清液0.45μm濾膜過(guò)濾后上樣檢測(cè)。

1.2.5不同劑量萃取劑回收率比較。分別取血液和肌肉各4份，血液和肌肉各取1份作為空白對(duì)照，其余分別加入土霉素1μg；用5%高氯酸1mL、10mL和10mL（2次）萃取回收檢測(cè)。

1.2.6固相萃取不同溶劑洗脫雜質(zhì)回收效果比較。取血液2份，分別添加1μg、0.1μg的土霉素，使用10mL的5%高氯酸萃取，Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化。洗脫雜質(zhì)程序中，分別采用5%甲醇水和ddH2O洗脫，計(jì)算相對(duì)回收率。固相萃取程序如下：①依次用3mL甲醇、2mL的5%EDTA-2 Na、3mL的ddH2O平衡萃取柱；②萃取液過(guò)柱；③用5mL的5%甲醇水洗脫雜質(zhì)或者ddH2O洗脫雜質(zhì)；④負(fù)壓下抽干2min；⑤5mL甲醇洗脫樣品；⑥氮吹儀40℃水浴吹干，pH值2.5的0.01moL的NaH2PO4定容至1mL；⑦振蕩器振蕩1min，液相檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

土霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.005~10.000μg/mL之間線性關(guān)系良好，檢測(cè)限達(dá)0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，線性方程為y=35 500x+238，線性相關(guān)系數(shù)R=1.000 0（見(jiàn)圖1）。

2.2乙酸乙酯與5%高氯酸萃取效果比較

乙酸乙酯和高氯酸的回收率分別為50.3%、58.3%。高氯酸萃取回收率較乙酸乙酯高；乙酸乙酯萃取雜質(zhì)較多，但均與土霉素峰形分離完全。由于乙酸乙酯沸點(diǎn)低（77.2℃），容易濃縮，故在滿(mǎn)足檢測(cè)要求的前提下，為了節(jié)約樣品濃縮處理時(shí)間，乙酸乙酯仍是個(gè)較好的選擇（見(jiàn)圖2）。

2.35%高氯酸不同劑量萃取效果比較

在增大萃取劑用量的情況下，萃取效率明顯提高，但是1∶10之后，繼續(xù)增大萃取劑用量，回收率提高不大。在試驗(yàn)要求允許的情況下，為了節(jié)約試劑、時(shí)間及濃縮的方便，1∶10萃取較好（見(jiàn)表1）。

2.4固相萃取不同溶劑洗脫雜質(zhì)回收效果比較

5%的甲醇水洗脫雜質(zhì)回收率明顯低于ddH2O效果，表明5%甲醇水會(huì)洗脫少量被分析物土霉素；同時(shí)隨著樣品中土霉素含量的提高，洗脫的比例也增加（見(jiàn)表2）。

3討論

（1）乙酸乙酯為低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑，常用于血液等組織中痕量物質(zhì)的回收處理。相對(duì)于常用的高氯酸和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液萃取方法，乙酸乙酯具有回收率接近，易于濃縮的優(yōu)勢(shì)。

（2）國(guó)標(biāo)SC/T 3015-2002方法中，5%高氯酸萃取后，使用正己烷去除樣品中的脂質(zhì)。本試驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)于血液等脂肪含量少的組織，不進(jìn)行除脂步驟不影響后期檢測(cè)。

（3）土霉素的固相萃取方法多使用C18或HLB固相萃取小柱進(jìn)行，均達(dá)到較好效果，其中HLB小柱的回收率及穩(wěn)定性?xún)?yōu)于C18。在凈化過(guò)程中，文獻(xiàn)中多使用5%甲醇水或ddH2O洗脫雜質(zhì)，其中Waters HLB推薦用法為5%甲醇水。本研究使用Waters HLB小柱凈化回收，發(fā)現(xiàn)使用ddH2O洗脫雜質(zhì)對(duì)土霉素的回收率在高中低（10μg、1μg、0.1μg）3個(gè)濃度加標(biāo)量土霉素的回收率均在90%左右，高濃度回收率更達(dá)98.1%，明顯高于5%甲醇水洗脫雜質(zhì)。

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