蘇定昌

摘要為探討不同干燥方式對(duì)銀杏植物中黃酮含量的影響,以高效液相色譜分析法測(cè)定以不同干燥方式處理后的銀杏葉總黃酮醇苷含量。結(jié)果表明,以曬干、陰干、烘干和微波干燥處理后,銀杏葉總黃酮含量分別為0.751%、0.849%、0.826%和0.884%,干燥方法以微波最好,陰干次之,曬干最差。直射光線對(duì)黃酮含量影響較大,在銀杏采集加工中,應(yīng)避免用曬干的方法處理。

關(guān)鍵詞銀杏葉;總黃酮;干燥方式;含量測(cè)定

中圖分類號(hào) S664.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)14-0078-02

銀杏(Ginkgo biloba)又名公孫樹,屬侏羅紀(jì)植物,被譽(yù)為植物界的“活化石”,是我國的特產(chǎn)植物,在湖北省恩施自治州種植十分廣泛,據(jù)統(tǒng)計(jì),截止2008年底,恩施州銀杏實(shí)有面積已達(dá)9 053.2hm2,產(chǎn)量達(dá)2 218t。銀杏樹在用材、綠化環(huán)境方面作用巨大,銀杏的種子又名白果,是傳統(tǒng)的滋補(bǔ)藥物和食物;其果、葉含有豐富的銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、去甲基銀杏雙黃酮及二萜內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C等,均可作藥用,其中銀杏葉中所含的槲皮素、山萘素、異鼠李素等黃酮化合物具有活血化淤、降低血脂、擴(kuò)張腦血管、清除自由基和抗衰老等功效和作用,已廣泛用于治療冠心病、心絞痛、治療老年癡呆癥和增強(qiáng)記憶功能、防治皮膚病、脫發(fā)等多種疾病[1]。如何更好地開發(fā)利用銀杏植物是當(dāng)前生物化學(xué)研究中的一大熱門,本研究采用高效液相色譜分析法測(cè)定以不同的干燥方式處理后銀杏葉總黃酮醇苷含量,探討銀杏采集加工中直射光線對(duì)黃酮含量的影響。

1材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1材料。銀杏葉于2008年6月下旬采于恩施州利川市團(tuán)堡鎮(zhèn)銀杏基地內(nèi),分別采用曬干、陰干、烘干和微波干燥4種方法進(jìn)行干燥處理。

1.1.2儀器。為美國PerKinElmer公司Series200高效液相色譜儀(包括Series200紫外檢測(cè)器、Series200二元泵、600Series接口及色譜工作站)。

1.1.3供試藥劑。槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為10081200406、110861200405、110860200407),甲醇(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心),磷酸(分析純,天津市化學(xué)試劑一廠),水為飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)生產(chǎn))。

1.2測(cè)定方法

1.2.1色譜條件。SymmetryC18色譜柱(4.6mm×250.0mm,5μm,美國Waters公司),流動(dòng)相為甲醇∶0.4%磷酸水溶液(52∶48),流速1mL/min,檢測(cè)波長370nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μL。

1.2.2溶液制備。①對(duì)照品溶液。精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素、山萘素、異鼠李素對(duì)照品適量(分別為15.6mg、17.0mg、10.0mg)置100mL量瓶中,加甲醇微熱使溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用。②樣品溶液。分別稱取經(jīng)4種方法進(jìn)行干燥處理后的銀杏樣品各1.50g,60℃水浴回流提取8h,過濾,濾液定容分別至50mL,搖勻后各取lmL,置于10mL刻度試管中,用甲醇稀釋至刻度,供分析用。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別精密量取對(duì)照品貯備液2mL、4mL、8 mL,置于100mL容量瓶中,充分混勻,用甲醇稀釋至刻度,制成3份對(duì)照品溶液(濃度分別為槲皮素:12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL;山柰酚:6μg/mL、12μg/mL、24μg/mL;異鼠李素:2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL),按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:

槲皮素:A=80 074C-52 255,r=0.999 4,線性范圍為15.6~78.0μg/mL;山萘素:A=63 168C+35 558,r=0.998 2,線性范圍為17.0~85.0μg/mL;異鼠李素:A=60 465C+20 840,r=0.999 6,線性范圍為10.0~50.0μg/mL。范圍內(nèi)與各自的峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

1.2.4重復(fù)性試驗(yàn)。取樣品溶液各3份作試品溶液,按上述色譜條件測(cè)得槲皮素、山萘素和異鼠李素的含量,按下式[2]換算成總黃酮醇苷的含量。

總黃酮醇苷=(槲皮素含量+山萘素含量+異鼠李素含量)×2.51。

1.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取樣品溶液,每隔1h按上述方法測(cè)定1次。結(jié)果含量分別為:0h為35.37%,1h為35.70%,2h為35.36%,4h為35.25%,5h為35.21%,6h為35.10%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.6%,結(jié)果表明樣品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)性的選擇及pH值對(duì)色譜分離的影響

銀杏葉經(jīng)酸水解后,含有3種主要黃酮甙元,由于黃酮甙元的酚羥基易于電離,組分峰拖尾,加入磷酸調(diào)整流動(dòng)相pH值為2.5,組分峰的對(duì)稱性良好,色譜圖見圖1。

2.2不同干燥方法對(duì)葉中銀杏黃酮含量的影響

從表1可以看出,干燥方法以微波干燥最好,陰干次之,曬干最差,微波與曬干相比, 黃酮苷含量相1.33 mg/mL。

3結(jié)論與討論

3.1測(cè)定銀杏葉中黃酮化合物的方法

銀杏葉中黃酮類物質(zhì)主要有槲皮素(Quercetin,Q)、山萘酚(Kaempferal,K)和異鼠李素(Isorhamntein,I)3種,它們主要以葡萄糖、鼠李糖等結(jié)合而成的糖苷形式存在[2]。測(cè)定銀杏葉中黃酮化合物的方法很多,如導(dǎo)數(shù)光譜法、近紅外光譜法、分光光度法、示波極譜法、熒光光度法、庫侖滴定法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法等[2]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定銀杏葉中的槲皮素、山萘素、異鼠李素等黃酮化合物的含量,結(jié)果表明,采用上述方法對(duì)復(fù)方銀杏葉片中主要活性成分槲皮素、山萘素、異鼠李素等黃酮化合物的含量進(jìn)行測(cè)定,方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、精確度高、分離效果良好。取對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液分別進(jìn)行紫外掃描,在200~300nm兩者均有較強(qiáng)吸收,在300~400nm陰性對(duì)照溶液吸收較小,在370nm波長下,這3種黃酮幾乎有相同的定量因子f值(單位峰面積),相對(duì)誤差不大于0.6%,故選擇在370nm作為槲皮素、山萘素、異鼠李素的測(cè)定波長。試驗(yàn)過程中選擇甲醇∶0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相,并對(duì)流動(dòng)相組成比例進(jìn)行選擇,結(jié)果表明,各色譜峰分離度良好,峰型尖銳,保留時(shí)間適中。

3.2干燥方法的影響

銀杏葉黃酮類化合物在受熱時(shí)容易發(fā)生酚性氧化反應(yīng),從而使活性成分的含量降低,黃酮類化合物的物理化學(xué)變化在提取分離時(shí)已經(jīng)開始,并延續(xù)至濃縮干燥過程。在銀杏葉的采集加工中,干燥方法的選用非常重要,實(shí)驗(yàn)室常用的干燥方法有噴霧干燥、真空干燥、微波干燥、常壓烘干等方法。其中,噴霧干燥因受熱時(shí)間短,有效成分破壞較少,微波干燥利用高速旋轉(zhuǎn)的水分子,達(dá)到加熱的同時(shí),也加速對(duì)苷類成分的水解,可減少黃酮損失[4]。這2種方法都是較先進(jìn)的干燥方法。本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。但在生產(chǎn)實(shí)踐中,大規(guī)模采集加工銀杏葉選用噴霧干燥、真空干燥、微波干燥、常壓烘干都不太現(xiàn)實(shí),相比之下,以陰干和在60℃條件下烘干比較好。這是因?yàn)橹鄙涔饩€對(duì)黃酮含量影響較大,采集加工銀杏葉應(yīng)避免用曬干的方法,可采用陰干的方式處理。

4參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)(2005年版)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

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