陳賢瑜

摘要: 隨著化學發(fā)光免疫分析方法的日趨成熟，各種技術與化學發(fā)光免疫分析的聯(lián)用成為一種發(fā)展趨勢。本文介紹了化學發(fā)光免疫分析主要類型及化學發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術，重點對化學發(fā)光免疫成像進行了分析和研究。

關鍵詞: 化學發(fā)光；聯(lián)用技術；免疫成像

1化學發(fā)光免疫分析概述

化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光劑包括發(fā)光物質或者發(fā)光反應催化劑等直接標記抗體或抗原的一類免疫測定方法。將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應結合起來，藉以檢測抗原或抗體的分析技術。將發(fā)光物質或酶標記在抗原或抗體上，免疫反應后，通過化學發(fā)光反應來測定發(fā)光標記物或酶標記物的化學發(fā)光信號，從而確定待測抗原或抗體的濃度，它同時具有化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性，其主要的優(yōu)點在于:(1)高靈敏度:由于不需要外來光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比RIA或EIA高1至2個數量級;(2)發(fā)光標記物穩(wěn)定，有效期長，大多數發(fā)光標記物可保存數月甚至數年;(3)檢測范圍寬;(4)自動化程度高，不僅可以大大提高檢測工作效率，而且避免了手工操作可能帶來的誤差，提高了分析方法的精密度。

根據其標一記物的不同可分為三大類:標記酶的化學發(fā)光免疫分析，其中應用最多的是三種酶，依據HRP-Luminol-H202一對碘苯酚(PIP)增強型化學發(fā)光反應體系進行檢測的辣根過氧化物酶(HRP)，能催化AMPPD的分解反應從而產生化學發(fā)光進行抗原抗體定量分析的堿性磷酸酶(ALP)，另一種是蟲熒光素酶，能催化氧化蟲熒光素產生發(fā)光而實現對ATP、各種激素、藥物以及抗原抗體的定量分析:標記化學發(fā)光物質的化學發(fā)光免疫分析，最典型的是標一記氨基異魯米諾(ABEI)和叮睫酷類的化學發(fā)光免疫分析:另一種是標記熒光物質，通過過氧化草酸酷化學發(fā)光體系進行檢測的化學發(fā)光免疫分析。

2 化學發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術

流動注射化學發(fā)光免疫分析(FI-CLIA)。流動注射免疫分析(FIIA)是利用在非平衡態(tài)測定，使反應時間縮短、更利于快速測定和自動化。FI-CLIA在環(huán)境和臨床的應用都已有許多文獻報道。20世紀80年代末至90年代初，Kramer等就開始研究流動注射免疫分析應用于環(huán)境中的殺蟲劑、除草劑的分析。利用FIIA是一種靈敏性、專一性、準確性好，快速、節(jié)約成本的方法，樣品也不需要預處理和富集。Wittmann等用FIIA和纖維光學免疫傳感器兩種方法對水樣中2,4-D進行測定。而且FIIA方法不需要對水樣預處理。GC/MS測定結果和FIIA測定數據具有良好的相關性。FIIA是一種集流動注射的重現性好和免疫分析的特異性強、靈敏度高等優(yōu)點于一體的現代醫(yī)藥檢驗方法，隨著流動注射分析技術、免疫柱制備技術和抗原、抗體標記技術的日臻成熟，其分析靈敏度、重現性和特異性將大大提高，既節(jié)約了分析時間，又降低了成本。目前，隨著其它現代分析技術的不斷發(fā)展，FIIA涌現出許多新技術和新方法。

高效液相色譜化學發(fā)光免疫分析法(HPLC-CLIA)。由于藥物和代謝物結構之間的相似性，在免疫分析中出現假陽性，此時如果利用HPLC的分離技術對分子間微小差別的高識別能力，再和化學發(fā)光免疫分析相結合，可大大提高特異性，成為一種有效的痕量和超痕量分離分析技術。

化學發(fā)光免疫成像分析法(CLIAI)?；瘜W發(fā)光免疫分析與成像技術聯(lián)用，形成化學發(fā)光免疫成像分析。成像技術是將某些特效反應所釋放的能量通過電荷偶合裝置，用高分辨率的相機以積分的形式拍攝下來。它可提供直觀圖像、可用在不同空間層次或時間過程中，能產生光學圖像的動態(tài)信息，當與化學發(fā)光免疫分析法聯(lián)用，可用于抗原、抗體的測定，對生物分析、醫(yī)學臨床診斷等也顯得更為方便。利用化學發(fā)光免疫成像分析法進行污染物如2, 4-D、乙酞膽堿醋酶和殘留農藥的檢測以及親血色珠蛋白的分型等具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、操作方便等優(yōu)點，這為醫(yī)學、食品、水源等環(huán)境中有毒害物質進行大規(guī)模、高通量、多元化、快速檢測提供可能。

3 化學發(fā)光免疫成像分析

化學發(fā)光免疫成像分析法盯是化學發(fā)光免疫分析與成像技術聯(lián)用而發(fā)展起來的一種既具有化學發(fā)光冤疫分析高靈敏度，又具有成像技術高通量優(yōu)勢，并能實現多樣品同時檢測的新方法。經過不同模式的抗原抗體的免疫結合過程，加入化學發(fā)光底物，標記在抗原抗體上的酶可以催化底物間的化學反應，所產生的化學發(fā)光信號用超靈敏的CCD進行捕捉，并以積分的形式轉化成數學信號顯示出來。

CCD是基于金屬一氧化物一半導體(MOS)技術的光敏元件，它是一種以電荷量表示光量大小、用藕合方式傳輸電荷量的新型器件。新型CCD具有光電轉換效率高、波長相應范圍寬、低溫下暗電流幾乎等于零、動態(tài)線性范圍寬、陣列結構的多通道同時分析等優(yōu)點。這樣化學發(fā)光免疫成像分析既具有化學發(fā)光免疫分析高靈敏度、高特異性、發(fā)光標記物穩(wěn)定、線性范圍寬、自動化程度高等優(yōu)點，還具有成像分析高通量、能實現多樣品的同時檢測等優(yōu)勢。

化學發(fā)光免疫成像分析法按照抗原抗體包被載體的不同，可以分為化學發(fā)光酶標板免疫成像分析，化學發(fā)光微陣列免疫成像分析和化學發(fā)光微全分析系統(tǒng)免疫成像分析。

3.1 化學發(fā)光酶標板免疫成像分析

通過成像設備，很容易實現對酶標板上產生的化學發(fā)光信號值的測定，且對于商業(yè)化的發(fā)光儀器，還可以實現對多塊標準酶標板的同時成像。傳統(tǒng)的讀板器是一個孔一個孔讀板，記錄發(fā)光信號值，但發(fā)光成像儀可以實現對整個酶標板發(fā)光信號的一次性讀取，尤其對于高密度的孔板(384孔板或更多)，化學發(fā)光成像記錄發(fā)光信號值的速度更是大大快于傳統(tǒng)的讀板器?；瘜W發(fā)光成像具有高分辨率的檢測設備，能夠避免相鄰發(fā)光反應孔的干擾，這在高密度的孔板檢測中具有尤為重要的意義，但由于反應孔存在深度，會產生陰影和光反射，這就會對不同位置的發(fā)光信號產生不同影響，但可以通過光校正加以消除。

化學發(fā)光成像分析法具有高靈敏度、樣品或者分析物需要量小，在高密度孔板分析中具有強大優(yōu)勢等特點，因此它有助于分析方法朝高通量成像方向發(fā)展。

例如，A.Andreani對乙酞膽堿酷酶抑制劑進行了化學發(fā)光免疫成像分析，采用384孔板可以在一個小時完成5000多個樣品分析。目前應用最廣泛的是Luminol化學發(fā)光免疫成像體系，它已應用在抗原抗體細胞因子、病毒、激素，腫瘤標記物，重金屬離子等目標分子以及實際樣品分析中。

3.2 化學發(fā)光微全分析系統(tǒng)免疫成像分析

成像檢測的高分辨率和高靈敏度是化學發(fā)光成像分析與微全分析系統(tǒng)相結合的主要原因，因為微全分析系統(tǒng)的樣品用量小，因此更需要非常靈敏的檢測手段。例如與化學發(fā)光免疫成像分析檢測多種樣品中的2，4-D含量相比，加入了未激活的固相載體(如金包被的固體表面或者玻璃毛細管)，該固相載體具有所有固相載體的大部分優(yōu)點。采用間接ELSIA法，牛奶中抗生素的快速自動化分析。三方向的流通生物芯片，由有序的玻璃微通道組成，發(fā)展成為化學發(fā)光檢測多組雜交過程。

3.3 化學發(fā)光微陣列免疫成像分析

微陣列技術允許上千種分析物質的在單一實驗中的同時分析，它的非凡力量是通過基因陣列表達分析實現的。通過配位結合反應如抗原一抗體或配體一受體反應建立的蛋白質陣列，在醫(yī)學研究、診斷學、蛋白物質和藥品發(fā)明中變得越來越重要。以化學發(fā)光成像技術作為檢測手段，基于抗原抗體反應的微陣列具有ELISA法的特異性、化學發(fā)光方法的高靈敏度和陣列分析法高通量的優(yōu)點。選擇高分辨率的成像設備是化學發(fā)光微陣列分析法得到更佳發(fā)展的必要選擇，因為成像分析可以實現在大量分析物發(fā)光信號值的同時檢測。通過將抗體特異性結合到膜上，蛋白質微陣列可用于抗體和細胞因子的多重檢測。該膜經過在樣品或者分析物中孵育而結合了樣品或者分析物，然后用HRP標記抗體和增強型化學發(fā)光底物進行化學發(fā)光分析。該分析法不需要很復雜的設備，能實現多樣品的同時分析，并且具有高的特異性和靈敏度。Z. Sun等利用蛋白質微陣列對12種腫瘤標記物進行了化學發(fā)光免疫成像分析，并且提高了單一腫瘤標記物檢測診斷方法的靈敏度和特異性。蛋白質微陣列在身體檢查中的應用表明了它在協(xié)助腫瘤診斷和高危人群的病癥診斷方面具有可行性。

參考文獻

[1]歐陽津，化學發(fā)光成像技術分析親血色珠蛋白的類型，福州大學學報，1999

[2]汪爾康主編，分析化學研究進展[M]，北京:科學出版社，2002