林召豐　王子龍　王志耕

摘要 以實驗室保存的3株保加利亞乳桿菌和3株嗜熱鏈球菌制作酸奶，研究蛋白酶、β-半乳糖苷酶和酸度在酸奶冷藏過程中的變化規(guī)律和相關性。結果表明，在酸奶冷藏過程中，酸度值與蛋白酶活力總體呈上升趨勢，但蛋白酶活力變化不呈規(guī)律性，β-半乳糖苷酶活力總體呈下降趨勢。酸度與蛋白酶呈正相關，酸度與β-半乳糖苷酶呈負相關。

關鍵詞 酸奶；酸度；β-半乳糖苷酶；蛋白酶

中圖分類號 TU252.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0212-02

酸奶是牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而制得的乳制品。保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）是酸奶生產(chǎn)中常用的發(fā)酵劑菌種[1-3]。不同的菌株之間產(chǎn)酸能力有所不同，產(chǎn)酸能力是酸奶生產(chǎn)用菌種篩選的重要考量指標，一般以產(chǎn)酸能力中等，同時前產(chǎn)酸力較強，后產(chǎn)酸較弱為優(yōu)良菌種篩選標準。目前關于發(fā)酵菌的產(chǎn)酸特性、β-半乳糖苷酶的酶學特性的研究已有不少報道，但關于乳酸菌蛋白酶的研究工作開展不多，而酸乳冷藏過程中的產(chǎn)酸特性與β-半乳糖苷酶和蛋白酶關系的研究很少。筆者以實驗室保存的6株乳酸菌制得的酸奶為基礎，研究酸度、β-半乳糖苷酶和蛋白酶在酸乳冷藏過程中的變化規(guī)律及相互關系，探討乳酸菌活動過程中的產(chǎn)酸機理，以期為酸乳生產(chǎn)試驗和產(chǎn)品研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種。供試菌種為實驗室保藏的保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus0602，S.thermophilus0606，S.thermophil us0607）。

1.1.2 培養(yǎng)基。牛奶培養(yǎng)基：10%脫脂奶粉于121℃加熱15min。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑。三氯乙酸（TCA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、鄰苯二甲醛（OPA）、β-巰基乙醇、硼酸鈉、甲醇、0.5%酚酞酒精指示劑、0.1moL/L NaOH、溶菌酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、ONP、ONPG。

1.2.2 主要儀器設備。Tu-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、HH-S型電熱恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）、BECKMAN型高速冷凍離心機（美國）、SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器廠有限公司）和KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸奶制備。以滅過菌的10%的脫脂牛奶為培養(yǎng)基，按3%接種量分別接入保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus 0602，S.thermophilus0606，S.thermophilus0607）。按此方法制成的酸奶分別定為“酸乳L.b01”、“酸乳L.b02”、“酸乳L.b06”、“酸乳S.t02”、“酸乳S.t06”、“酸乳S.t07”。

1.3.2 酸度測定。采用酸堿滴定法。用標定過的濃度為0.1 moL/L的氫氧化鈉標準溶液滴定，求出酸度。同一樣品，至少連測3 次，取平均值[5]。

1.3.3 β-半乳糖苷酶的測定。將酸奶制品溶于冷的1% EDTA（pH值為12，4℃）溶液中（每1g酸奶溶于20mg EDTA），4℃、15 000rpm離心10min得菌體沉淀，將菌體細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0，0.1moL/L KH2PO4、5moL/L Mg SO4，0.1moL/L MnCl2）中，用0.2%的溶菌酶和凍融法進行細胞破壁[6]。破壁之后將樣品離心，去除細胞殘骸和未破壁細胞，得到β-半乳糖苷酶液。采用ONPG為酶作用底物，生成有色產(chǎn)物ONP，通過比色法測定[7]。

1.3.4 蛋白酶的測定。用蛋白水解力（總游離氨基酸量）反映蛋白酶活力，蛋白水解力測定采用OPA試劑法[8]。

1.3.5 統(tǒng)計方法。利用Excel軟件和SAS8.2軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的酸度變化

由表1可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶酸度值間存在差異，酸度值隨冷藏天數(shù)的增加呈上升趨勢。通過SAS的ANOVA過程對表1的數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，冷藏15d時，L.b06酸乳的酸度值高于S.t02、S.t06、S.t07、L.b01、L.b02酸乳的酸度值。但在冷藏至11d時發(fā)生了后酸化現(xiàn)象，S.t02、S.t06的產(chǎn)酸能力處于中等水平，后期產(chǎn)酸比較緩慢，未發(fā)生后酸化現(xiàn)象，適宜做優(yōu)良的產(chǎn)酸發(fā)酵劑。

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中β-半乳糖苷酶活力變化

由表2可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值間存在差異，β-半乳糖苷酶值隨冷藏天數(shù)的增加總體呈下降趨勢，并且β-半乳糖苷酶在冷藏過程中的活力比較小，除酸乳S.t02、S.t06、L.b01在開始有所上升隨后呈下降趨勢外，其他酸乳均呈下降趨勢。通過SAS的ANOVA過程對表2的數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，冷藏到15d時，酸乳S.t02、S.t06產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值明顯高于酸乳S.t07、L.b06、L.b01、L.b02產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的蛋白酶活力變化

由表3可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶產(chǎn)生的蛋白酶值間存在差異，蛋白酶值隨冷藏天數(shù)的增加總體呈上升趨勢，但變化并不呈一定的規(guī)律性。通過SAS的ANOVA過程對表3的數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，冷藏到15d時，酸乳S.t02產(chǎn)生的蛋白酶值明顯高于酸乳S.t06、S.t07、L.b06、L.b01、L.b02產(chǎn)生的蛋白酶值，S.t06產(chǎn)生的蛋白酶值高于酸乳S.t07、L.b01產(chǎn)生的蛋白酶值。

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的酸度與β-半乳糖苷酶和蛋白酶活力的相關性

從表4可見，冷藏到15d時，酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈負相關，酸度值與蛋白酶活力呈正相關。其中S.t02的酸度值與蛋白酶活力呈顯著正相關（P＜0.05），S.t07的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈顯著負相關（P＜0.05），S.t07的酸度值與蛋白酶活力呈極顯著正相關（P＜0.01），L.b06的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈極顯著負相關（P＜0.01），L.b02的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈顯著負相關（P＜0.05）。綜合分析可見，由保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸乳在冷藏過程中的酸度值與β-半乳糖苷酶活力的相關性大，由嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸乳在冷藏過程中的酸度值與蛋白酶活力的相關性大。

3 結論與討論

（1）酸奶的風味很大程度上取決于酸度，因此研究酸奶中乳酸菌在冷藏過程中的產(chǎn)酸能力對酸奶發(fā)酵劑菌種的選擇具有重要意義。適度的蛋白水解可改善制品風味和品質，特別是乳酸菌蛋白水解和菌體破裂釋放的酶對酸奶成熟發(fā)揮著重要作用。β-半乳糖苷酶活性高低，對外表現(xiàn)為能不能有效地利用乳糖，它可以將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，之后單糖被分解代謝，在乳糖代謝中起著重要作用。

（2）乳酸菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等，其中乳酸是乳酸菌將乳中的乳糖分解而得到的，是酸乳酸度的主要來源。而乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶分解所產(chǎn)生的乳酸，反過來又抑制β-半乳糖苷酶的活性，使其活性下降，并且乳酸對不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的β-半乳糖苷酶活力抑制程度不同，這使不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的β-半乳糖苷酶活性大小不同，并且下降幅度存在差異。但在冷藏到15d時，β-半乳糖苷酶活力還有進一步下降的可能，此時的乳酸度還不足以抑制β-半乳糖苷酶的活性。由上述分析可知，β-半乳糖苷酶可作為酸奶冷藏過程中的關鍵酶。

（3）S.t02的蛋白酶活力從一開始就居高不下，變化卻不呈一定規(guī)律性，這一點可以反映出S.t02具有較高的蛋白酶活力，開始的變化幅度比較小，可能原因是乳酸菌的生長攝取了自身酶分解蛋白質釋放的游離氨基酸。

4 參考文獻

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