尹宏宇　孫　劍　劉廣鵬　崔　磊　曹誼林

[摘要]目的：骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）是構(gòu)建組織工程化骨主要的種子細胞，實現(xiàn)BMSCs的深低溫保存對骨組織工程具有重要意義。目前，玻璃化凍存是最有發(fā)展前景的凍存方法，因此希望通過改進玻璃化液和預處理條件來提高BMSCs的玻璃化凍存效果。方法：采用不同組成及濃度的玻璃化液在不同的預處理條件下對第2（P2）代成骨誘導的犬骨髓基質(zhì)干細胞（cBMSCs）進行玻璃化凍存實驗，通過復蘇后的細胞存活率來選擇一種理想的玻璃化液及適合的預處理條件，并在此基礎(chǔ)上再與常規(guī)凍存的實驗結(jié)果進行比較，同時考慮凍存過程對細胞成骨活性的影響。結(jié)果：將VS226作為玻璃化液，在0℃/5min的預處理條件下玻璃化凍存P2代成骨誘導的cBMSCs，與常規(guī)凍存后的細胞存活率相比無統(tǒng)計學差異，且凍存過程對此細胞的成骨能力沒有影響。結(jié)論：采用VS226來玻璃化凍存BMSCs，可實現(xiàn)為骨組織工程提供大量種子細胞的目的。

[關(guān)鍵詞]深低溫保存；玻璃化凍存；骨組織工程；骨髓基質(zhì)干細胞

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0318-05

Experimental study of vitrification preservation for BMSCs

YIN Hong-yu1, SUN Jian3, LIU Guang-peng3,CUI Lei2,3,CAO Yi-lin1,2,3

(1. Research Center Of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College, Beijing 100041, China; 2.Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3.Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200234, China.)

Abstract: Objective Bone marrow stromal cells (BMSCs) have become the main cell source for tissue-engineered bone. There is of great significance for bone tissue engineering to cryopreserved BMSCs. At present, vitrification preservation is the most promising methods of cryopreservation for cells. The effect of vitrification method for BMSCs was wished to enhance by improving the vitrified solution and the pretreatment condition. Methods Using the different composition and concentration of vitrification fluid, the freezing experiments on osteogenically induced canine bone marrow stromal cells (cBMSCs) at passage 2 (P2) were performed under the different preconditioning. According to the cellular survival rate after rewarming, the ideal vitrification media and optimal pretreatments were chosen to cryopreserve the cells in order to compare with the experimental result of slow-freezing. Simultaneously, the influence of vitrification protocol on osteogenic activity of the cells needed to be considered. Results Taking the VS226 as a vitreous cryoprotectant, osteo-induced cBMSCs at P2 were banked under 0℃/5min of the pretreatment condition. There was no statistical significance of percent cell viability post-thaw between routine and vitrification method, and the cooling process did not affect osteogenic ability of the cells. Conclusions Based on these results, it can be concluded that BMSCs frozen by vitrification with VS226 can be used to provide the massive seed cell for bone tissue engineering.

Key words: cryopreservation; vitrification; bone tissue engineering; bone marrow stromal cells

組織工程學是一門以細胞生物學和材料學相結(jié)合, 進行體外和體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學科[1]。構(gòu)建的方法主要是在支架材料上接種高濃度的種子細胞進行復合培養(yǎng)。骨組織工程是組織工程的主要分支，其種子細胞以成骨誘導的BMSCs為主，因此組織工程化骨的構(gòu)建迫切需要進行大量種子細胞的冷凍貯備。玻璃化凍存技術(shù)是近年來低溫生物學領(lǐng)域發(fā)展最快的研究方向之一。本文通過采用一種新研制的玻璃化液對成骨誘導的cBMSCs進行玻璃化凍存的研究，以期能使組織工程化骨的種子細胞獲得理想的玻璃化凍存效果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 動物：2歲齡Beagle犬3條，雌雄不限，體重約20kg，上海農(nóng)學院提供。

1.1.2 試劑：Percoll原液：77237 Percoll （sigma公司，美國）；BM Purple染色劑（Boehringer Mannheim公司，德國）；茜素紅染液（sigma公司，美國）。

1.2方法

1.2.1 cBMSCs的分離和體外誘導培養(yǎng)：將實驗犬以5 %的戊巴比妥鈉（0.5ml/Kg）麻醉后，抽取骨髓2.5ml。根據(jù)以前報道的方法[2]進行Percoll液的配制和犬骨髓單個核細胞的分離提純。將原代細胞接種培養(yǎng)48h后開始應用含有地塞米松（10mmol/L）、β-磷酸甘油鈉（2.16g/L）和2-磷酸抗壞血酸（37.5mg/L）的成骨條件培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行成骨誘導培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至第8天，細胞克隆形成單位的中心生長達密集時用0.25 %胰蛋白酶-0.02%EDTA進行第1次傳代[3]。以1.6×104/cm2的細胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。

1.2.2 凍存液的制備：常規(guī)凍存液由體積比為10%二甲基亞砜（DMSO）、50%胎牛血清（FBS）和40%細胞培養(yǎng)液（DMEM）組成；根據(jù)文獻[4]制備玻璃化液VS55；其它玻璃化液參見表1（根據(jù)文獻[4]制備EC液）。

1.2.3細胞的深低溫保存方法：①常規(guī)凍存：將P2代成骨誘導的cBMSCs消化離心后倒除上清液，用0.5ml常規(guī)凍存液重懸并置入2ml凍存管中，先在4℃預冷30min，再置于-20℃ 2h，經(jīng)過24h的-80℃保存后投入液氮（-196℃）；②玻璃化凍存：將同樣方法獲得的細胞用同體積的玻璃化液重懸于凍存管中，經(jīng)過不同的預處理方案，包括將凍存管放入冰水混合物(0℃)中或置于室溫（25℃）下分別保持5min或15min后再直接投入液氮，或立即投入液氮（0min）。

1.2.4 深低溫保存細胞的復蘇方法：從液氮中取出冷凍保存1天的凍存管，在37℃ 水浴中快速搖晃進行復溫，將復溫后的細胞溶液迅速轉(zhuǎn)移到離心管中并加入成骨條件培養(yǎng)液進行稀釋，離心（1 500 轉(zhuǎn)/min，5 min）后去上清液，共洗滌2次。

1.2.5 深低溫保存細胞復蘇后的細胞存活率[5]：將3×105個P2代成骨誘導的cBMSCs連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細胞總數(shù)，根據(jù)公式：增殖率=細胞總數(shù)÷(3×105)，來獲得未凍存細胞的增殖率。然后深低溫保存3×105個此細胞，凍存1天后復蘇，繼續(xù)成骨誘導培養(yǎng)6天，同樣獲取培養(yǎng)后的細胞總數(shù)，利用公式：細胞存活率=培養(yǎng)后細胞總數(shù)÷(3×105×增殖率)，以得出凍存細胞的存活率。

1.2.6 生化檢測：根據(jù)以前報道的方法[2]分別將P2代成骨誘導的cBMSCs進行凍存前后的堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色。。

1.2.7 統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件處理，行t檢驗。每個檢測樣本重復3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 不同玻璃化液在不同的預處理條件下進行玻璃化凍存對細胞存活率的影響：如圖1所示，用不同的玻璃化液對P2代成骨誘導的cBMSCs進行玻璃化凍存，不論預處理時間是0min、5min，還是15min，預處理溫度為0℃時的細胞存活率明顯高于25℃（P<0.05）。在同樣的預處理溫度下，VS28、VS226和VS55的細胞存活率5min和15min明顯優(yōu)于0min（P<0.05），且5min和15min之間無統(tǒng)計學差異；VS37和VS334的細胞存活率5min>15min>0min（P<0.05）；VS46和VS442則5min明顯優(yōu)于15min 和0min（P<0.05）。由此可見，在0℃條件下用玻璃化液對此細胞進行預處理5min的玻璃化凍存效果最好。對于不同組分和配比的玻璃化液，不論是室溫還是冰水混合物的情況下，只要有預處理時間（5min或15min），含有EC液成分的玻璃化液的細胞存活率均好于不含EC液的結(jié)果（P<0.05），而在0min的無預處理時差別不明顯，因此EC液成分是有助于細胞的玻璃化凍存。對DMSO而言，只要細胞在玻璃化凍存前進行過預處理（5min或15min），隨著DMSO濃度的增加凍存后的細胞存活率顯著降低（P<0.05），說明較高濃度的DMSO不利于細胞的玻璃化凍存。同時發(fā)現(xiàn)，25℃時高濃度DMSO的細胞存活率下降程度高于0℃時的情況（P<0.05），說明在低溫環(huán)境下可減輕高濃度DMSO對細胞的損傷。在檢測的各種玻璃化液中，用VS226玻璃化凍存細胞的存活率最高，在0℃/5min的預處理條件下可達73.0%±3.1%，由此被選作下一步實驗的玻璃化液。

2.2 玻璃化凍存與常規(guī)凍存對細胞存活率的影響：同樣對P2代成骨誘導的cBMSCs進行深低溫保存，玻璃化凍存用VS226作為凍存液，預處理條件選擇在冰水混合物中預冷5min，從圖2可見，玻璃化凍存后的細胞存活率為75.0%±3.5%，而常規(guī)凍存是77.0%±2.4%，二者并無統(tǒng)計學差異，由此可見玻璃化凍存細胞達到了與常規(guī)凍存同樣的效果。

2.3 凍存對細胞成骨活性的影響：不論是玻璃化凍存還是常規(guī)凍存，經(jīng)體外成骨誘導培養(yǎng)的P2代cBMSCs的ALP染色和茜素紅染色在凍存前后均為陽性。ALP染色的細胞胞漿呈藍、綠色（圖3A）。茜素紅染色的細胞外基質(zhì)中可出現(xiàn)散在的結(jié)節(jié)狀紅染，在鈣化沉積區(qū)為深紅色，中心呈黑色（圖3B）。

3討論

凍存主要用于對細胞和組織的保存，隨著組織工程的發(fā)展使凍存的作用顯得尤為重要[6]。常規(guī)凍存[7]是通過添加冷凍保護劑、采用一定降溫程序緩慢降溫的一種方法。由于這種慢速冷凍方法比較成熟, 在許多研究領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的使用。玻璃化凍存是用高濃度且低毒的多種冷凍保護劑的協(xié)同效應使細胞脫水到合適程度，然后通過快速降溫（常常會超過1 500℃/min），使含高含量防凍劑的液體粘滯度升高，液體分子的彌散運動被抑制，液體固化為一種類似于玻璃的非晶體狀態(tài)[8]。該方法是深低溫保存的新技術(shù)，不僅操作方法簡便、快速, 不需昂貴的降溫設(shè)備，而且在快速降溫和復溫過程中迅速通過-5℃～-15℃的冷凍危險區(qū)，從而防止了冰晶的產(chǎn)生，或雖有冰晶形成但沒有長大到足以使細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的程度，進而避免或減輕了細胞內(nèi)外冰晶和溶質(zhì)效應對胞膜和細胞骨架等的損傷。因此與常規(guī)凍存相比，玻璃化凍存可以達到更好的深低溫保存效果。1985年，Rall 等[9]首先使用玻璃化法成功地進行了小鼠胚胎的冷凍保存?，F(xiàn)在，此冷凍方法已成功地凍存了人類胚胎[10]、卵子[11]和人類干細胞[12]等生物材料。

玻璃化冷凍在避免冰晶形成的同時，有潛在增強化學毒性的趨勢。這主要是由于高含量冷凍保護劑具有毒性作用。因此低毒性的，高滲透性的冷凍保護劑組合是其關(guān)鍵。冷凍保護劑可分成兩大類，即滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑。大量的資料[13-15]表明聯(lián)合運用這兩種作用機制不同的凍存保護劑進行玻璃化凍存，可以加強冷凍效果和減輕毒性。

DMSO是最常見的滲透性冷凍保護劑，它的高度水溶性使其易于透過細胞膜，并在細胞內(nèi)外形成高滲透壓，補償了胞內(nèi)、胞外存在的鹽梯度，因此可防止細胞內(nèi)的冰晶形成和細胞膜的破壞[16]。EC液是器官保存灌洗液的金標準[17]。作為模擬細胞內(nèi)電解質(zhì)成分和濃度的EC液可具有磷酸鹽緩沖作用，并擁有著可保持高滲透壓的葡萄糖（一種非滲透性冷凍保護劑）[18]，實驗結(jié)果也證明了加入EC液成分的玻璃化液具有很好的細胞凍存效果。眾所周知，細胞培養(yǎng)液包含著細胞生長所必需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，而其中的血清成分已被研究證明有利于細胞凍存[19]。本實驗所用的玻璃化液就是由此配制而成，結(jié)果顯示用VS226進行細胞的玻璃化凍存明顯優(yōu)于其他的玻璃化液。這是因為30%和40%的DMSO濃度較高，對細胞傷害較大，而20%的濃度則是細胞保護和細胞毒性之間一個最佳點。同時此三種成分的合理配比使玻璃化凍存后的細胞存活率超過了VS55，并達到了常規(guī)凍存的效果。由此可見，VS226是一種理想的玻璃化凍存液。

為將玻璃化凍存中的細胞毒性損傷減小到最低限度,當然還需要嚴格控制細胞與冷凍保護劑溶液接觸的溫度和時間，加快降溫和復溫的速率。實驗結(jié)果指出預處理溫度為0℃的玻璃化凍存效果好于25℃，這是因為低溫環(huán)境可減少DMSO的細胞毒性[20]。而預處理時間以5min為最佳，這是由于將細胞與冷凍保護劑預先接觸可降低凍存過程中的滲透壓突變對細胞的打擊，而過長的接觸時間又會增加凍存液對細胞的毒性損傷。

自從Vajta[21]發(fā)明了開放型拉細凍存麥管(open pulled straw, OPS)，冷凍速率增至20000℃/min，大大加快了降溫復溫速率和提高了細胞存活率。但因吸入管內(nèi)液體僅為2μl，極大的限制了凍存細胞的數(shù)量，然而組織工程所需的細胞數(shù)量又較大，可見OPS法是很難滿足的。但常規(guī)的2ml凍存管卻可實現(xiàn)此要求，因此實驗選用凍存管成裝細胞懸液。同時為增加熱交換率，實驗僅用0.5ml的凍存液來混合細胞，以希望獲得更大的降溫和復溫的速率。但畢竟此方法無法達到OPS法的冷凍速率，這也說明了本實驗的細胞存活率不是非常高的原因。

由于在液氮（-196℃）溫度下，細胞、組織內(nèi)各種酶的活力及代謝很低，幾乎為零，生命處于所謂的“停滯”狀態(tài)。在此溫度下凍存的細胞，理論上可無限期保存[22]。鑒于深低溫保存的時間并不是問題，因此本實驗選用1天作為凍存的時間。

Kadiyala等[3]研究指出cBMSCs從P2代以后的細胞活性即開始降低，這也就是為什么選用P2的cBMSCs進行本實驗的原因。目前，成骨誘導的BMSCs是骨組織工程重要的種子細胞，凍存細胞不但要保證高的細胞存活率，而且還要保持細胞的成骨活性。本實驗經(jīng)過生化檢測驗證了凍存過程并未影響成骨誘導cBMSCs的成骨能力。因此玻璃化凍存完全可以滿足骨組織工程中對細胞冷凍保存的要求。

總之，用VS226作為玻璃化液，經(jīng)0℃/5min的預處理后對P2代成骨誘導的cBMSCs進行玻璃化凍存，復蘇后的細胞存活率達到了與常規(guī)凍存相同的效果。

[參考文獻]

[1]曹誼林.組織工程學理論與實踐[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社, 2004:3.

[2]尹宏宇, 劉廣鵬, 崔磊，等. Percoll法分離犬骨髓單個核細胞與體外成骨誘導培養(yǎng)的實驗研究[J]. 組織工程與重建外科雜志, 2007, 3(5):277-279.

[3]Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro[J]. Cell Transplant, 1997, 6(2):125-134.

[4]Mehl PM. Nucleation and crystal growth in a vitrification solution tested for organ cryopreservation by vitrification[J]. Cryobiology, 1993, 30(5):509-518.

[5]Liu BL, McGrath J, McCabe L, et al. Response of murine osteoblasts and porous hydroxyapatite (HA) scaffolds to two-step, slow freezing and vitrification processes[J]. Cell Preservation Technol, 2002, 1(1):33-44.

[6]Kuleshovaa LL, Gouka SS, Hutmacher DW. Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs[J]. Biomaterials, 2007, 28(9):1585-1596.

[7]Bianchi V, Coticchio G, Fava L, et al. Meiotic spindle imaging in human oocytes frozen with a slow freezing procedure involving high sucrose concentration[J]. HumReprod, 2005, 20(4):1078-1083.

[8]Fahy GM, Macfarlane DR, Angell CA, et al. Vitrification as an approach to cryopreservation[J]. Cryobiology, 1984, 21(4):407-426.

[9]Rall WF, Fahy GM. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification[J]. Nature, 1985, 313(6003):573-575.

[10]Son WY, Lee SY, Chang MJ, et al. Pregnancy resulting from transfer of repeat vitrified blastocysts produced by in-vitro matured oocytes in patient with polycystic ovary syndrome[J]. Reprod Biomed Online, 2005,10(3):398-401.

[11]Kyono K, Fuchinoue K, Yagi A, et al. Successful pregnancy and delivery after transfer of a single blastocyst derived from a vitrified mature human oocyte[J]. Fertil Steril, 2005, 84(4):1017.

[12]Zhou CQ, Mai QY, Li T, et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells by vitrification[J]. Chin Med J, 2004, 117(7):1050-1055.

[13]Cai X Y, Chen GA,Lian Y, et al. Cryoloop vitrification of rabbit oocytes[J]. Hum Reprod, 2005, 20(7):1969-1974.

[14]Selman H, Angelini A, Barnocchi N, et al. Ongoing pregnancies after vitrification of human oocytes using a combined solution of ethylene glycol and dimethyl sulfoxide[J]. Fert Steril,2006, 86(4):997-1000.

[15]Sheehan CB, Lane M, Gardner DK, et al. The CryoLoop facilitates revitrification of embryos at four successive stages of development without impairing embryo growth[J]. Hum Reprod,2006, 21(11):2978-2984.

[16]Gorlin J. Stem cell cryopreservation[J]. J Infus Chemother,1996,6(1):23-27.

[17]Hausen B, Beuke M, Schroeder F, et al. In vivo measurement of lung preservation solution efficacy: comparison of LPD, UW, EC and low K+-EC following short and extended ischemia[J]. Eur J Cardiothorac Surg,1997,12(5):771-780.

[18]Jassem W, Armeni T, Quiles JL, et al. Protection of mitochondria during cold storage of liver and following transplantation: comparison of the two solutions, University of Wisconsin and Eurocollins[J]. J Bioenerg Biomembr,2006,38(1):49-55.

[10]Shim H, GutierrezAdan A, Chen LR, et al. Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells[J]. Biol Reprod, 1997, 57(5):1089-1095.

[20]Wusteman MC, Pegg DE. Differences in the requirements for cryopreservation of porcine aortic smooth muscle and endothelial cells[J]. Tissue Eng,2001,7(5):507-518.

[21]Vajta G,Holm P,Kuwayama M,et al. Open Pulled Straw (OPS) vitrification : a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos[J]. Mol Reprod Dev, 1998, 51(1): 53-58.

[22]Karlsson JO, Toner M. Long-term storage of tissues by cryopreservation: critical issues[J]. Biomaterials,1996,17(3):243-256.

[收稿日期]2008-11-12[修回日期]2009-02-08

編輯/張惠娟