[摘要] 目的 觀察白花丹參對野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓(PAH)模型血流動力學(xué)及肺組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 SD(sprsgue-dauley SD)大鼠一次性皮下注射MCT 60 mg/kg體重，建立PAH動物模型，隨機(jī)分為正常對照組、模型組和白花丹參水提物給藥組。觀察白花丹參水提物對PAH大鼠血流動力學(xué)、肺血管重構(gòu)及肺組織VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果 與模型組相比，給藥組大鼠平均肺動脈壓(mPAP)、右心室收縮壓(RVSP)、右心指數(shù)及肺組織VEGF表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，肺血管重構(gòu)及右心功能也有所改善。結(jié)論 白花丹參水提物能有效控制MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH發(fā)展進(jìn)程，其機(jī)制可能與降低肺組織VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 白花丹參; 大鼠; 肺動脈高壓; 血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號] R285.5;R331.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)33-06-03

Effect of White Flowers Salvia on Lung Vascular Endothelial Growth Factor Expression of Pulmonary Arterial Hypertension Rats

WANG Yun YANG Nana CAO Shaohua ZHAO Xiaomin XIA Zuoli

Taishan Medical College，Institute of Life Science，Taian 271000，China

[Abstract] ObjectiveTo observe the effects of White Flowers Salvia on hemodynamic changes and lung vascular endothelial growth factor(VEGF)expression of pulmonary arterial hypertension(PAH)in rats induced by monocrotaline(MCT). MethodsPAH was induced in rats by a single subcutaneous injection of MCT at a dose of 60 mg/kg. Then the rats were randomly divided into normal control，model and drug groups. Hemodynamic changes and pathological changes of the lung and VEGF expression were detected. ResultsCompared with the model group，the mPAP，RVSP，right ventricular index and VEGF expression of rats in the drug group were significantly decreased，and the lung artery remodeling and the right ventricular functions were also improved. ConclusionThe aqueous extract of White Flowers Salvia can effectively control the process of PAH，which may be related to its role in decreasing the lung VEGF expression.

[Key words]White Flowers Salvia; Rat; Pulmonary arterial hypertension; Vascular endothelial growth factor

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，由多種原因引起、以肺動脈血管結(jié)構(gòu)重建和右心室肥大為特征。傳統(tǒng)中藥丹參(salvia m ilt io rrh iza bunge，SMB )屬唇形科(lab iatae)鼠尾草屬植物。藥理實驗表明，其具有保護(hù)心肌、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用，有明顯阻抑低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺血管結(jié)構(gòu)重建的功效[1]，但對野百合堿(MCT)所誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型的影響研究較少。泰山白花丹參(salvia m iltiorrhiza Bge.f.alba C.Y.WU.et H.W.Li)是丹參的變種，為山東特有珍稀瀕危藥用植物。本實驗以 MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠為模型，觀察泰山白花丹參對其影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野百合堿(日本W(wǎng)ako公司)，肝素(天津市生物化學(xué)制藥廠，批號20041107)，右心導(dǎo)管(聚乙烯心導(dǎo)管，內(nèi)徑0.6 mm，外徑0.9 mm)，MP150多導(dǎo)生理信號記錄儀(美國BIOPAC公司)，鼠抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物分組及給藥

SPF級SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雄性，體重180～220g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(魯)20050015。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組和給藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。自由攝食攝水，晝夜時間1:1。模型組和給藥組一次性頸背部皮下注射2% MCT 60 mg/kg體重造模，正常對照組代以注射等量的生理鹽水。白花丹參根洗凈涼干，用蒸餾水浸泡2 h，煮沸30 min，過濾，藥渣加3～5倍量水，繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾，合并濾液，經(jīng)濃縮，最后用水調(diào)整至所需濃度[2]。造模后第2天起，給藥組給予白花丹參14g/kg體重灌胃，每天1次，模型組代以等量的生理鹽水。

1.3 一般狀況

各組動物分別于入實驗室分組前、造模前每周測量體重，每天觀察動物的一般狀況、毛發(fā)、活動、進(jìn)食等情況。

1.4 血流動力學(xué)檢測

動物飼養(yǎng)到期后(第22天)，稱重，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定、消毒。頸正中偏右切口，分離出右頸外靜脈，應(yīng)用多導(dǎo)生理信號記錄系統(tǒng)，按孫波[3]法測量右心室收縮壓(RVSP)和平均肺動脈壓(mPAP)，并計錄右心室(RV)收縮和舒張指數(shù)(dp/dt)。同時，從左側(cè)股動脈插管，同步記錄體循環(huán)壓力(MAP)。

1.5 右心指數(shù)測定及病理觀察

記錄完畢，心臟取血備用。取血后立即處死大鼠，剖開胸腔，分離心、肺，浸入冷生理鹽水中漂洗后，分離左、右心室，用濾紙吸去血液、鹽水，分別稱取右心室(RV)和左心室加室間隔(LV + S)的重量，計算右心肥大指數(shù)RV/(S+LV)。將肺部分放入4%的多聚甲醛中固定，在左肺中部切下小塊組織，行石蠟包埋，切片予以蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織的病理改變情況。

1.6 Western blot法檢測肺組織VEGF表達(dá)

組織總蛋白的提取及測量:取部分肺組織，充分剪碎，低溫液氮研磨后，加到含蛋白酶抑制劑的裂解液中，4℃裂解40min，使其充分裂解，4℃ 12000r/min，離心30min，棄除沉淀，BCA蛋白定量測定法檢測上清液蛋白含量。樣品分裝、貯存于-80℃中待用。Western blot:每份樣本上樣50μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:100V電泳 1h。100mA濕法轉(zhuǎn)印40min。室溫封閉1h后，一抗1∶500(鼠抗鼠VEGF單克隆抗體)4℃孵育過夜，TTBS洗膜;二抗1∶2000室溫孵育2h，TTBS洗膜，BCIP/NBT顯色10min。凝膠成像采圖，Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物的一般狀況

實驗前、造模前各組動物體重及一般情況無差別，毛發(fā)順且有光澤。實驗過程中，正常組體重明顯增加，一般情況良好。模型組大鼠體重上升緩慢、進(jìn)食減少、毛發(fā)枯糙無光澤、一般狀況較差。給藥組情況介于兩者之間。

2.2 血流動力學(xué)檢測結(jié)果

見表1。

2.3 光鏡下病理觀察結(jié)果

正常對照組:肺泡結(jié)構(gòu)清晰，泡壁毛細(xì)血管無擴(kuò)張充血，肺泡上皮完整，腔內(nèi)無滲出物，間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺小動脈血管壁無增厚，血管腔無狹窄;模型組;肺泡壁明顯增厚，其上毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)可見少量水腫液，肺組織有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，肺小動脈血管壁明顯增厚，中膜平滑肌層數(shù)增多，管腔明顯狹窄、閉塞;給藥組:肺泡壁有少量充血或炎性細(xì)胞浸潤，肺泡無明顯擴(kuò)大，肺小動脈血管壁中度增厚，管腔縮小不明顯。

2.4 右心指數(shù)及VEGF測定結(jié)果

見表2。

3 討論

PAH是晚期肺疾病的常見并發(fā)癥，預(yù)后差。無論是缺氧還是MCT 性PAH 的發(fā)展過程，均存在肺血管床的結(jié)構(gòu)改變。MCT通過損傷肺動脈血管內(nèi)皮，使膠原纖維暴露，肺動脈血管內(nèi)血栓形成，誘導(dǎo)肺動脈血管壁的重建，導(dǎo)致pH、右心肥厚[4]，是經(jīng)典的復(fù)制PH 模型的方法之一。丹參作為傳統(tǒng)的活血化瘀藥，有抗動脈粥樣硬化、鈣拮抗、抗炎、抗腫瘤、抗氧化損傷以及中樞抑制等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治。近幾年來，丹參藥理研究又有一些新進(jìn)展。一系列研究顯示，丹參對各種因素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[5]。本實驗結(jié)果表明，模型組與正常對照組相比，mPAP，RVSP和右心指數(shù)均明顯升高(P<0.05)，光鏡下見小動脈血管壁明顯增厚，血管腔狹窄、閉塞，伴炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變，給藥組大鼠的mPAP，RVSP和右心指數(shù)均比模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且病理觀察結(jié)果也有所改善。dp/dt max是評價心肌收縮性能的常用指標(biāo)，在一定程度上受心率及前后負(fù)荷的影響并與其呈正相關(guān);dp/dt min是心肌舒張參數(shù)，作為評價心室舒張功能的指標(biāo)之一有重要意義。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠右心室的dp/dt max和dP/dt min均比正常對照組有明顯升高(P<0.05)，與Tiago HC等[6]報道一致，提示心肌收縮與舒張功能均有所增強(qiáng)，這可能是對肺動脈壓力升高的一種代償反應(yīng)，而給藥組大鼠的dp/dt max和dP/dt min比模型組有所降低，提示丹參能有效控制肺血管重構(gòu)和右心室肥厚，并能改善右心功能。血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)肺血管增生方面起著重要的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成和分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有明顯的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管形成的作用，體外實驗已證實低氧可引起肺組織中VEGF及其受體的表達(dá)增多[7]。Chohreh Partovian 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFmRNA表達(dá)在MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠(30d后)肺組織內(nèi)下降90%，而在低氧性肺動脈高壓大鼠的肺組織內(nèi)基本無變化。在我們的實驗中，模型組大鼠肺組織VEGF蛋白表達(dá)比正常對照組顯著升高，這可能是基因表達(dá)與蛋白表達(dá)存在一定的時間差距所致。丹參給藥組大鼠的肺組織VEGF蛋白表達(dá)比模型組顯著降低，這一結(jié)果提示VEGF可能參與了MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓形成過程中肺血管的重構(gòu)過程，而丹參有效控制肺血管重構(gòu)的作用可能與通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞而降低肺組織VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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[5] 裴少偉，崔俊彪，羅莉，等. 丹參對慢性肺心病肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26(10):63-91.

[6] Tiago HC，Jorge CP，Roberto RA，et al. Endogenous productin of ghrelin and beneficial effects of its exogenous administration in monocrotaline- induced pulmonary hypertention[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004， 287(6):2885-2890.

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[8] Chohreh Partovian，Serge Adnot，Saadia Eddahibi，et al. Heart and lung VEGF mRNA expression in rats with monocrotaline-or hypoxia-induced pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，1998，275:1948-1956.

(收稿日期:2009-06-16)