[摘要] 目的 研究早期宮頸癌患者外周血中MAGEA3和hSTC1 mRNA的表達(dá)及臨床意義。方法 采用RT-PCR法檢測(cè)60例ⅠA~ⅡA期宮頸癌患者及15例同期入院的排除其他惡性腫瘤的子宮肌瘤患者外周血中MAGEA3和hSTC1 mRNA的表達(dá)，并分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果 60例早期宮頸癌患者外周血中MAGEA3和hSTC1 mRNA的陽性表達(dá)率分別為46.67%（28/60）和40%（24/60），子宮腫瘤均為0%。MAGEA3和hSTC1 mRNA的單獨(dú)陽性表達(dá)率和雙陽性表達(dá)率除與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管瘤栓顯著相關(guān)外（P＜0.05），與宮頸癌的預(yù)后因素如年齡、分期、分化、組織類型、腫瘤大小均無關(guān)（P＞0.05），但隨著腫瘤分期及肌層浸潤(rùn)深度的增加有逐步上升的趨勢(shì)。結(jié)論 MAGEA3和hSTC1可作為檢測(cè)早期宮頸癌外周血微轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)，但對(duì)預(yù)后的意義有待于進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；MAGEA3 mRNA；hSTC1 mRNA；外周血；RT-PCR

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2009）12-13-03

Detection of MAGEA3 mRNA and hSTC1 mRNA in Peripheral Blood of Patients with Early Stage Cervical Cancer and Its Clinical Significance

ZHAO XinlingLU AiniLIAO Yumei

Department of Gynecology，Second Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000

[Abstract] Objective To study the expression of MAGEA3 and hSTC1 mRNA in peripheral blood of patients with FIGO Stage IA to IIA cervical cancer and to investigate its clinical significance. Methods Using the reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），MAGEA3 and hSTC1 mRNA expression was examined in peripheral blood from 60 patients with early cervical cancer before operation. As control，15 patients with uterine myoma were also investigated. Results The positive rate for MAGEA3 and hSTC1 mRNA expression were 46.7%（28/60） and 40%（24/60） in 40 cervical cancer respectively，0% and 0% in uterine myoma. The expression of MAGEA3 or hSTC1 mRNA were significantly associated with lymph node metastasis and lymphvascular involvement（P < 0.05）， but not with prognostic factors including stage，differentiation，pathological types，bully tumour size，stromal invition，same to the expression of both two. Conclusion MAGEA3 and hSTC1 may be potential biomarkers for detecting micrometastasis in peripheral blood of patients with early stage cervical cancer，but the predictive value needs further studies.

[Key Words] Cervical carcinoma； MAGEA3 mRNA； hSTC1 mRNA Peripheral blood； RT-PC

ⅠA～ⅡA期宮頸癌根治術(shù)后，約35%出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，是因?yàn)槟[瘤微轉(zhuǎn)移的存在。我們采用RT-PCR檢測(cè)宮頸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞MAGEA3和hSTC1 mRNA的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2007年8月～2008年11月我院收治的ⅠA～ⅡA期的宮頸癌患者60例，年齡27～71歲，平均46.7歲，所有病例均經(jīng)病理檢查確診且未經(jīng)化療，于術(shù)前抽取外周血。同時(shí)，取15例新鮮的宮頸癌組織及術(shù)后病理診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的區(qū)域淋巴結(jié)15枚做陽性對(duì)照，15例同期入院手術(shù)的子宮肌瘤患者外周血做良性對(duì)照，以雙蒸水為cDNA模板做陰性對(duì)照。

1.2主要試劑及引物設(shè)計(jì)合成

淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅?，RNA Guard（普利萊），Trizol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），PCR試劑盒（Tiangen），引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。見表1。

1.3方法

1.3.1 樣本處理及總RNA提取空腹時(shí)抽取第二管血3～5mL，枸櫞酸鈉抗凝，于30min內(nèi)用Ficoll淋巴細(xì)胞分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆?。癌組織取0.5cm³，淋巴結(jié)取肉眼觀可疑癌轉(zhuǎn)移者，沿縱軸剖開，標(biāo)號(hào)后一半送病理，一半留用（術(shù)后病理確診為癌轉(zhuǎn)移）。組織置RNA Guard，4℃冰箱過夜，-80℃保存?zhèn)溆谩rizol法提取細(xì)胞和組織的總RNA，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度儀測(cè)量，判斷RNA純度，要求OD260/OD280＞1.8。

1.3.2RT-PCR按Fermentas的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將每例標(biāo)本的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)條件：94℃ 3min，94℃ 30s，57℃（MAGEA3）/53℃（hSTC1） 30s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物6μl，2%瓊脂糖凝膠電泳90v，40min，紫外透射反射儀下拍照記錄并分析結(jié)果。結(jié)果判定：154bp（β-actin），243bp（hSTC1），327bp（MAGEA3）。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用Excel軟件收集數(shù)據(jù)并建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)數(shù)資料采用率表示，SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組間率的比較用x²檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2結(jié)果

60例宮頸癌外周血單個(gè)核細(xì)胞，15例宮頸癌癌組織，15例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌及15例子宮肌瘤外周血單個(gè)核細(xì)胞均擴(kuò)增出片段大小154bp的內(nèi)參對(duì)照β–actin，所有標(biāo)本均進(jìn)行MAGEA3和hSTC1 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1，2。

2.1對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組MAGEA3和hSTC1 mRNA的表達(dá)（表2）

15例癌組織中MAGEA3和hSTC1全部陽性（100.0%），15例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的MAGEA3和hSTC1 的陽性表達(dá)分別為13（86.7%），12（80.0%）。15例良性對(duì)照中無一例陽性。

60例宮頸癌外周血MAGEA3陽性28例（46.7%），hSTC1陽性24例（40.0%），兩者均陽性18例（30.0%），兩者均陰性者42例（70.0%），兩者至少一項(xiàng)陽性者34例（56.7%）。外周血組與癌組織組及良性對(duì)照組比較，陽性表達(dá)率有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2外周血MAGEA3和hSTC1 mRNA表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)，早期宮頸癌外周血MAGEA3和hSTC1 mRNA陽性表達(dá)率與年齡，病理類型，細(xì)胞分化程度，期別，腫瘤大小及浸潤(rùn)深度無明顯相關(guān)性，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)呈顯著相關(guān)（P＜0.05），見表3。但隨著期別及浸潤(rùn)深度的增加，MAGEA3和hSTC1 mRNA陽性表達(dá)率呈上升趨勢(shì)。

3討論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是目前腫瘤微轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)之一。由于數(shù)目非常少，檢測(cè)技術(shù)必須具有高度的敏感性和特異性，RT-PCR技術(shù)可在106～107個(gè)正常外周血細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)腫瘤細(xì)胞[1]，是目前檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移的有效方法。

斯鈣素（Stanniocalcin）是一種最初在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，近年來發(fā)現(xiàn)hSTC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。hSTC1存在于人類多種不同腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中，包括肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、直腸癌腎上腺癌等[2-4]。Fujiwara等[2]用RT-PCR檢測(cè)到多種癌組織包括乳腺癌、胃癌、腸癌中均有hSTC1 mRNA的表達(dá)，而在正常人血液中不表達(dá)。Robert等[5]通過對(duì)8種乳腺癌細(xì)胞株、34個(gè)原發(fā)性乳腺癌腫瘤使用RT-PCR方法來檢測(cè)hSTC1 mRNA的表達(dá)的研究也得出類似的結(jié)論。hSTC1可以作為檢測(cè)腫瘤外周血微轉(zhuǎn)移的一個(gè)特異性較高的新指標(biāo)。

黑色素瘤抗原（Melanoma antigen-encoding，MAGE）是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)性抗原（Tumor-associated antigen，TAA）。有A、B、C、D、E、F六個(gè)亞組。MAGEA主要表達(dá)于黑色素瘤為主的惡性腫瘤組織中，其表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切，而在除睪丸組織和胎盤組織外的正常組織中幾乎不表達(dá)。Lonchay等[6]發(fā)現(xiàn)MAGEA1和MAGEA3是惡性腫瘤最常表達(dá)的兩種基因，Miyashiro等[7]發(fā)現(xiàn)MAGE家族各成員在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中的表達(dá)率均高于原發(fā)未轉(zhuǎn)移者，可做為腫瘤轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。張澎等[8]報(bào)道，在不同臨床分期、病理分型的肺癌標(biāo)本中MAGEA3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

我們采用RT-PCR技術(shù)研究腫瘤特異性的微轉(zhuǎn)移標(biāo)志物hSTC1和MAGEA3在宮頸癌的表達(dá)及臨床意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在癌組織中全部表達(dá)，在良性對(duì)照組中全不表達(dá)，特異性100%；但以病理結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的表達(dá)率分別為86.67%，80%，靈敏度并不理想，考慮可能與取材有關(guān)。由于病理檢查的要求，試驗(yàn)只能對(duì)部分淋巴結(jié)取材，而轉(zhuǎn)移的癌灶部分可能正好并未取到。

將腫瘤患者實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床病理結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，hSTC1和MAGEA3在早期宮頸癌和對(duì)照組中的陽性率分別為46.7%和0，40%和0，差異有顯著性（P﹤0.05），說明RT-PCR法檢測(cè)宮頸癌外周血中的hSTC1和MAGEA3 mRNA來判斷微轉(zhuǎn)移是可行的。黃培林等[9]報(bào)道hSTC1在大腸癌患者外周血的陽性率為49.12%，與腫瘤的臨床分期有關(guān)，與性別，年齡，細(xì)胞分化程度無明顯相關(guān)。吳平平等[10]報(bào)道食管癌，胃癌，大腸癌外周血中的hSTC1的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，hSTC1和MAGEA3的單獨(dú)陽性及雙陽性表達(dá)分別為37.5%，30%，25%，如果以任一陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)率可提高到56.7%。陽性表達(dá)僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管瘤栓有相關(guān)性（P＜0.05），與宮頸癌的預(yù)后因素如年齡、分期、分化、組織類型、腫瘤大小均無關(guān)（P＞0.05），但隨著期別及浸潤(rùn)深度的增加，它們的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，考慮可能與樣本量小有關(guān)，需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行更加深入的研究。60例中hSTC1和MAGEA3的表達(dá)雙陽性18例，hSTC1陽性24例，僅MAGEA3陽性28例，兩種腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)有交叉但不完全重疊。若以任一陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，聯(lián)合檢測(cè)可增加敏感性，提高檢出率。末梢血液標(biāo)本容易獲得和被患者接受，且可反復(fù)取樣，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。根據(jù)癌細(xì)胞間斷進(jìn)入血液循環(huán)的特性，可以重復(fù)采樣提高檢測(cè)的陽性率。

本研究結(jié)果提示早期宮頸癌外周血中存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而且特異性非常高，但并不是說將來一定能夠發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶。郭文忠等[11]的試驗(yàn)表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞只有大約0.01%最終能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶，相當(dāng)于1mL血中存在2個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽性結(jié)果至少說明腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性增加了，且往往由于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)等高危因素，因此給予必要的監(jiān)測(cè)和預(yù)防性治療，有可能減少術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，改善預(yù)后，提高生存率。

總之，本研究結(jié)果提示，早期宮頸癌患者外周血中存在腫瘤細(xì)胞，通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)hSTC1和MAGEA3 mRNA的表達(dá)判斷循環(huán)腫瘤細(xì)胞是可行的，二者在宮頸癌微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)中均為較好的標(biāo)志物，為判斷早期宮頸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后及防治提供了理論依據(jù)。我們將對(duì)本組病例進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，以明確外周血中hSTC1和MAGEA3 mRNA的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

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（收稿日期：2009-02-04）