摘要：哺乳動(dòng)物卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射技術(shù)發(fā)展很快，而且已在很多領(lǐng)域發(fā)揮其重要的作用。簡單綜述了哺乳動(dòng)物卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射(ICSI)的研究概況、存在的問題以及今后的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：哺乳動(dòng)物；卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射；進(jìn)展

中圖分類號(hào)：Q954.44 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114(2009)01—0236—03

顯微受精是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型的體外受精技術(shù)。即借助顯微操作儀，將精子直接或精子細(xì)胞注入卵母細(xì)胞內(nèi)(或卵周隙)，促使其在體外相互結(jié)合的技術(shù)，這項(xiàng)新技術(shù)是體外受精和顯微操作技術(shù)相結(jié)合而形成的，也可以說是顯微操作輔助受精，目前顯微受精技術(shù)主要有3種途徑：①透明帶開孔技術(shù)(PZD)；②卵透明帶下注射技術(shù)(SUZI)；③卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射技術(shù)(ICSI)。其中①PZD不為人們接受的主要原因是需要足夠量的精子。⑦SUZI法受精令人失望的缺點(diǎn)是多精受精難以控制。而③ICSI就克服了①PZD和②SUZI的缺點(diǎn)。ICSI是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一項(xiàng)新型的體外受精技術(shù)，它是借助顯微操作儀，將一個(gè)精子或生精細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。使精卵結(jié)合完成受精的過程。ICSI技術(shù)可排除透明帶和卵質(zhì)膜對(duì)精子人卵的阻礙作用。故對(duì)精子的死活及其完整性無嚴(yán)格要求。因此一躍成為當(dāng)前顯微受精技術(shù)的主流，廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)、野生動(dòng)物保護(hù)、人類的深度不育和受精機(jī)理的理論研究中。

1 哺乳動(dòng)物卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射受精的效果

關(guān)于卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射受精的效果，國內(nèi)外已有很多成功的報(bào)道，但是針對(duì)不同的哺乳動(dòng)物而言，還存在一些問題。現(xiàn)簡單綜述如下。

小鼠單精注射的首次嘗試在1983年，但當(dāng)時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果很差，因?yàn)樾∈舐涯讣?xì)胞的質(zhì)膜缺乏彈性。直接注射精子時(shí)非常容易死亡。Kimura等對(duì)顯微操作儀進(jìn)行了改進(jìn)，采用Piezo-driven操作系統(tǒng)克服了小鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜抗損傷能力差的特點(diǎn)，使小鼠注射卵的存活率由16％提高到80％，囊胚率由33％提高到68％，產(chǎn)仔率達(dá)30％。之后，人們廣泛試驗(yàn)睪丸精子，精子頭，形態(tài)異常精子等各種極端條件處理下精子的受精產(chǎn)仔情況并取得了成功，證明了精子的新鮮度和活動(dòng)力對(duì)ICSI的結(jié)果沒有顯著影響。羅軍等報(bào)道了兔單精子胞質(zhì)內(nèi)注射受精的成功，獲得70％的桑椹胚和囊胚發(fā)育率，細(xì)胞胚胎移植后，順產(chǎn)4只健康仔兔。Hosoi等將不活動(dòng)但是活的兔精子注射到兔卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)獲得了胚胎，并獲得仔兔，證明了精子的活動(dòng)力對(duì)ICSI的結(jié)果沒有顯著影響。Sofikitis報(bào)道了兔球形精子細(xì)胞核ICSI的成功，并得到仔兔。Liu等將凍干的兔精子注射到卵胞質(zhì)，妊娠得1只仔兔，由于難產(chǎn)死掉了，這說明死精子也能用于ICSI獲得后代。首例在牛的ICSI上獲得成功的是Goto。將單個(gè)的死精子注入牛體外成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，再將注射卵人工激活。囊胚率達(dá)7.8％，獲得2頭ICSI試管牛。盧圣忠將解凍后的牛精子注入牛卵母細(xì)胞中。獲得19.9％的受精率和94％的分裂率。Katayose等將Piezo系統(tǒng)引入了牛的ICSI研究，并證明在牛的Piezo-ICSI中注射卵的激活不是必需的。隨后，Wei等也進(jìn)行了牛Piezo-ICSI試驗(yàn)，沒有進(jìn)行注射卵的激活，并成功獲得后代。Ldeta將DTF處理過的精子分別注入M I和MⅡ期的卵子內(nèi)，體外培養(yǎng)后胚胎分裂率沒有顯著差異，M I卵子的囊胚發(fā)育率(18-3％)明顯比MⅡ的低，說明牛的未成熟卵子ICSI效果不如成熟卵子，但是也有應(yīng)用于ICSI的潛力。尚需進(jìn)一步研究。牛向麗等進(jìn)行了水牛和黃牛種間的異種受精研究并取得了較好的體外發(fā)育效果。豬的ICSI起步較晚。最早是Hosoi等將豬活精子注入豬卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)觀察到原核形成。Martin首次報(bào)道體內(nèi)成熟卵子的ICSI。獲得分裂率為69％，囊胚率達(dá)到38％，移植后產(chǎn)下3只仔豬。目前因豬卵母細(xì)胞的體外成熟系統(tǒng)不夠完善、胞質(zhì)脂滴較多而使操作困難以及早期胚胎4-細(xì)胞阻滯發(fā)育使得豬ICSI整體效率較低，故得到存活后代的報(bào)道較少。Gomez將綿羊的精子注入體外成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活率30.6％，囊胚率8.5％，移植后獲得2只正常羊羔。顧文藝和郭志勤將綿羊精子可溶性提取物與單個(gè)不運(yùn)動(dòng)綿羊精子注入體外成熟的綿羊卵胞質(zhì)內(nèi)，囊胚的發(fā)育率達(dá)到5.1％，證明精子和精子提取物共同注射具有明顯促進(jìn)胚胎發(fā)育的作用。最早的雌雄原核是在ICSI后的2h和3h，IVF后4h形成。ICSI(28.6％)的受精率低于IVF(70.4％)。但是ICSI不正常受精率(8.7％)和IVF(15.2％)的差異不顯著。結(jié)果說明，ICSI的受精時(shí)間比IVF的早，ICSI后雌雄原核形成的時(shí)間不同步。這些結(jié)果對(duì)提高綿羊的ICSI效率十分有用。但山羊ICSI受精技術(shù)還很不成熟，有關(guān)方面的研究報(bào)道也很少。目前還未見報(bào)道有山羊精子經(jīng)ICSI有后代產(chǎn)生。Li等將注射后的卵子分別用離子霉素、乙醇、噻汞撒、三磷酸肌醇激活，發(fā)現(xiàn)這4種化學(xué)物質(zhì)都有顯著提高卵子激活率的作用，其中噻汞撒對(duì)提高馬的注射卵激活率和正常受精率的效果比其他幾種激活劑更好，但是化學(xué)激活同時(shí)也刺激部分卵子發(fā)生孤雌分裂。同年，Li等得到了歐洲第一只ICSI試管馬駒，這標(biāo)志著馬的ICSl已進(jìn)入一個(gè)新的階段，這項(xiàng)成果對(duì)馬生殖機(jī)理的研究及育種馬的應(yīng)用有著重要意義。Gallic等經(jīng)ICSI獲得胚胎冷凍，解凍后移植，有受體妊娠但沒有產(chǎn)仔。目前由于馬的體外成熟系統(tǒng)的限制，從而限制了胚胎以后的發(fā)育能力。

Lanzendorf等研究者首次報(bào)道了人精子直接注入卵胞質(zhì)后的原核形成。之后。取得突破性進(jìn)展的是Palermo等率先用人的卵母細(xì)胞上進(jìn)行ICSI，并成功誕生世界上首例ICSI試管嬰兒，ICSI技術(shù)成為了男性不育治療新的里程碑。對(duì)于有些男性患者，通常由于精子活力低或無精子而不能進(jìn)行傳統(tǒng)的體外受精，只能用睪丸內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞來進(jìn)行ICSI實(shí)現(xiàn)受精。近期研究結(jié)果表明，人睪丸精子細(xì)胞的ICSI妊娠率顯著低于射出精子的ICSI妊娠率。現(xiàn)階段對(duì)精子細(xì)胞的生物條件和應(yīng)用的臨床并發(fā)癥還沒有充分了解，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子細(xì)胞注射對(duì)不育癥的治療有許多爭議，還有許多問題有待研究，盡管如此，目前此方法對(duì)于非阻塞性無精癥患者無疑是惟一的選擇。

2 卵胞質(zhì)內(nèi)單精注射技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題

ICSI技術(shù)作為輔助受精的一種手段，在近10年獲得長足發(fā)展。ICSI技術(shù)在動(dòng)物受精機(jī)理研究、野生動(dòng)物遺傳資源保存、拯救珍稀動(dòng)物和胚胎工廠化生產(chǎn)等方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景。該技術(shù)已經(jīng)成為人類臨床醫(yī)學(xué)上治療男性不育癥的重要手段，并在全世界得到廣泛應(yīng)用。

盡管ICSI已取得很大成就，但是其存在的問題也不容忽視。首先，由于人為地選擇，動(dòng)物自身對(duì)精子優(yōu)勝劣汰的選擇遭到破壞。這對(duì)動(dòng)物種群的發(fā)展產(chǎn)生的影響還需長期深入的研究。如果能詳細(xì)了解精子的表型和基因型之間的關(guān)系，相信ICSI技術(shù)的可靠性會(huì)有所明確。其次，作為胚胎生物技術(shù)的一部分。ICSI技術(shù)也存在總體效率低的問題，而且胚胎移植后妊娠率低而流產(chǎn)率高亦是目前存在的普遍問題。另外，存在出生動(dòng)物的死亡和畸形等不良后果。因此要更深入地研究其機(jī)理和操作等問題，進(jìn)一步改善ICSI技術(shù)。